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Écrit par
Sylviane Chevreux
Publié par
Thesee
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N° d’ordre : 3880
THÈSE
PRÉSENTÉE A
L’UNIVERSITÉ BORDEAUX 1
ÉCOLE DOCTORALE DES SCIENCES CHIMIQUES
Par Sylviane CHEVREUX
POUR OBTENIR LE GRADE DE
DOCTEUR
SPÉCIALITÉ : CHIMIE ANALYTIQUE ET ENVIRONNEMENT
SPECIATION DIRECTE DE METALLOPROTEINES
SEPAREES SUR GELS D’ELECTROPHORESE :
ANALYSES XAS DE LA SUPEROXYDE DISMUTASE ET ICP-MS DE PROTEINES
ARSENIEES
Directeur de recherche : Richard Ortega
er
Soutenue le : 1 décembre 2009
Devant la commission d’examen formée de :
M. HAZEMANN Jean Louis, Directeur de recherche CNRS, Grenoble (Rapporteur)
M. LOBINSKI Ryszard, Directeur de recherche CNRS, Pau (Rapporteur)
M. MORETTO Philippe, Professeur, Université de Bordeaux 1 (Examinateur)
M. ORTEGA Richard, Directeur de recherche CNRS, Gradignan (Examinateur)
A mon père,
A Johnny, ma mère et mes sœurs,
A ma famille et mes amis,
Et au Pr Yves Pérel
4 REMERCIEMENTS
Le document que vous tenez actuellement entre vos mains ou que vous consultez sur
un écran d’ordinateur est issu d’un travail d’équipe. Il n’aurait ainsi pas pu voir le jour sans
l’aide de plusieurs personnes. A ce titre, je profite de la présence de cette section afin de
remercier ces différents contributeurs.
En tout premier lieu, je remercie mon jury de thèse, en les personnes de Jean Louis
Hazemann, Ryszard Lobinski, Philippe Moretto et Richard Ortega, pour avoir eu l’amabilité
d’accepter de faire partie de ce jury et pour s’être attentivement penché sur le contenu de ce
manuscrit et sur ma présentation afin de m’en donner un avis constructif.
Mes remerciements vont dans un second temps à Bernard Lavielle, directeur du
Laboratoire de Chimie Nucléaire Analytique et Bioenvironnementale (CNAB), pour m’avoir
accueillie au sein de son unité et à Richard Ortega, mon directeur de thèse, pour son
encadrement, sa disponibilité, l’aide qu’il m’a apporté dans certaines étapes de ce travail de
thèse et l’expertise qu’il m’a transmise dans son domaine.
Je remercie l’équipe du Groupe d’Imagerie Chimique Cellulaire et Spéciation du
CNAB, composée, outre Richard Ortega, de Guillaume Devès et Asunción Carmona, ainsi
que d’anciens membres de ce groupe, Stéphane Roudeau, Aurélien Fraysse et Thomas
Bacquart, pour m’avoir transmis leurs savoirs et savoir-faire dans leur spécialités respectives.
Pour la problématique de l’étude de la superoxyde dismutase à cuivre et zinc, mes
remerciements vont aux membres de la ligne ID26 (dont Pieter Glatzel et Tsu-Chien Weng) et
BM30b-FAME (dont Jean Louis Hazemann, Denis Testemale et Isabelle Alliot) de l’ESRF
pour m’avoir accueillie sur leurs lignes respectives et avoir permis d’effectuer des analyses
XAS de nos protéines séparées sur gel d’électrophorèse. Mes plus amples remerciements
s’adressent de même à Pier Lorenzo Solari, pour m’avoir guidé dans le traitement de données
EXAFS, mais aussi pour sa disponibilité, sa rigueur et ses conseils.
Pour la problématique de l’étude des protéines de réponse à l’arsenic, mes
remerciements visent le Laboratoire de Chimie Analytique Bio-Inorganique et
Environnement, dont Ryszard Lobinski, Sandra Mounicou, Christophe Pécheyran et Fanny
Claverie, pour m’avoir accueillie au sein de leur unité, pour leur disponibilité et pour avoir
ainsi eu l’amabilité d’effectuer les séparations chromatographiques de mes échantillons
protéiques, ainsi que les analyses par ICP-MS suivant les séparations des protéines par
chromatographie et électrophorèse sur gel.
5 Le bon déroulement d’une thèse nécessite la convergence de connaissances,
compétences et moyens apportés par l’entourage scientifique, mais il est aussi intimement lié
à l’entourage personnel, permettant de décompresser, se recharger et relativiser.
Je garde ainsi un excellent souvenir de soirées, concerts (B.B. King !!), repas, billards,
quiz au Frog & Rosbif (une seule victoire…), visites touristiques, séances de ciné et séances
jeux de rôles expérimentés avec différents personnels du CNAB, CENBG et LSM hors de
l’enceinte du campus : Annie-Claude, Arnaud, Benoît, Bertrand, Claire, Fredrik, Jebril,
Jérémy, Jérôme, Julien, Marie-Hélène G., Marie-Hélène V., Patrick, Pia, Serguei, Sylvie,
Thomas, Tina, Tony, Vanessa et Virginie. Mes encouragements à Guillaume, Thomas et
Vanessa qui seront les prochains doctorants du CNAB à soutenir leur thèse!
Un grand merci à mes amis, qui ont su me supporter, dans tous les sens du terme, ces
trois dernières années. Je ne les citerai pas tous pour ne pas monopoliser la place, mais je
pense plus particulièrement à Diana & Guillaume, Kamila, Nima, Thibault, Thomas, Tony et
Virginie & Eddy. Une pensée particulière pour Laura et Nadège qui sont restées en contact
malgré les années de séparation…
Et pour conclure, mes plus profonds remerciements aux deux éléments déclencheurs
de toute cette aventure, mon père et le Pr Pérel, et à ceux qui m’ont donné le courage de la
poursuivre, ma mère, mes sœurs, ma belle-mère et ma famille, notamment maternelle qui est
la plus proche du cœur malgré la distance. Et the last but not the least, merci Johnny, le pilier
et le co-artisan de cette thèse, je te dédicace les heures à écouter en boucle « The kill » et « A
beautiful lie » afin d’extérioriser tout ce stress !
6 Remerciements……….……………………………………………………………………….5
Introduction générale……………………………………………………………………….11
1. Etude d’un complexe métalloprotéique avec liaison non covalente : la superoxyde
dismutase à cuivre et zinc……………………………………………………………….19
1.1. Présentation du cadre de l’étude…………………………………………………..21
1.1.1. La superoxyde dismutase à cuivre et zinc…………………………………….21
1.1.2. Sclérose latérale amyotrophique et CuZnSOD……………………………….24
1.1.3. Cu et Zn de la CuZnSOD, lien avec la SLA………………………………….26
1.2. Préparation des échantillons……………………….………………………………30
1.2.1. Culture de levures…………………………………………………………….30
1.2.2. Extraction protéique…………………………………………………………..32
1.2.3. Dosage des protéines………………………………………………………….33
1.2.4. Prétraitements éventuels de la CuZnSOD…………………………………….34
1.2.4.1.Réduction et alkylation de la CuZnSOD………………………………….34
1.2.4.2.Exposition à H O ………………………………………………………...34 2 2
1.2.4.3.Exposition à ZnSO ……………………………………………………….35 4
1.2.5. Séparation des isoformes……………………………………………………..35
1.2.5.1.Focalisation isoélectrique…………………………………………………36
1.2.5.2.Electrophorèse bidimensionnelle sur gel de polyacrylamide……………..37
1.2.6. Détection de la CuZnSOD par coloration des gels d’électrophorèse…………38
1.2.7. Conditionnement et stockage des échantillons……………………………….39
1.2.7.1.Conditionnement et stockage des strips…………………………………..39
1.2.7.2.Conditionnement et stockage des gels bidimensionnels………………….39
1.3. Méthodes d’analyse…………………………………………………………………41
1.3.1. Emission de rayons X par particules chargées accélérées (PIXE, Particle-
Induced X-ray Emission)………………………………………………………..41
1.3.1.1.Principe de la technique…………………………………………………..41
1.3.1.2.Applications aux métalloprotéines………………………………………..42
1.3.1.3.Spécificités techniques lors de la mesure…………………………………43
1.3.2. Spectroscopie d’absorption des rayons X (XAS, X-ray Absorption
Spectroscopy)…………………………………………………………………...44
7 1.3.2.1.Principe de la technique…………………………………………………..44
1.3.2.1.1. XANES (X-ray Absorption Near-Edge Structure)……………….45
1.3.2.1.2. EXAFS (Extended X-ray Absorption Fine Structure)……………46
1.3.2.2.Applications aux métalloprotéines………………………………………..47
1.3.2.3.Spécificités techniques lors de la mesure…………………………………48
1.3.2.3.1. L’European Synchrotron Radiation Facility (ESRF, Grenoble)….48
1.3.2.3.2. La ligne de lumière ID26…………………………………………49
1.3.2.3.3. La ligne de lumière BM30b-FAME………………………………50
1.4. Résultats et discussion.……………………………………………………………..52
1.4.1. Etude de la nature des isoformes de la CuZnSOD : application sur des
CuZnSOD commerciales………………………………………………………..52
1.4.1.1. Point isoélectrique des isoformes natives de CuZnSOD………………...53
1.4.1.2. Réduction et alkylation de la CuZnSOD…………………………………55
1.4.1.3. Exposition de la CuZnSOD à ZnSO …………………………………….58 4
1.4.1.4. Quantification du Cu et Zn des isoformes de la CuZnSOD par PIXE…...60
1.4.1.5. Analyses XAS aux seuils du Zn et du Cu des isoformes de la
CuZnSOD………………………………………………………………