Avances en la sistemática del género Micromonospora: estudio de cepas aisladas de la Rizosfera y Nódulos de Pisum sativum

UNIVERSIDAD DE SALAMANCA

DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y GENÉTICA



















AVANCES EN LA SISTEMÁTICA DEL GÉNERO
Micromonospora: ESTUDIO DE CEPAS AISLADAS DE LA
RIZOSFERA Y NÓDULOS DE Pisum sativum









Memoria para optar al grado de doctor presentada por:

LORENA CARRO GARCÍA

Salamanca 2009 MARTHA E. TRUJILLO TOLEDO PROFESOR DOCTOR CONTRATADO
PERMANENTE DEL DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y GENÉTICA
DE LA UNIVERSIDAD DE SALAMANCA Y EUSTOQUIO MARTÍNEZ MOLINA,
PROFESOR CATEDRÁTICO DEL MISMO DEPARTAMENTO,




CERTIFICAMOS:


Que la memoria titulada AVANCES EN LA SISTEMÁTICA DEL GÉNERO
Micromonospora: ESTUDIO DE CEPAS AISLADAS DE LA RIZOSFERA Y NÓDULOS
DE Pisum sativum presentada por Lorena Carro García para optar el grado de Doctor por la
Universidad de Salamanca, ha sido realizada bajo nuestra dirección en el Departamento de
Microbiología y Genética de la Universidad de Salamanca.




Y para que así conste, extendemos el presente certificado en Salamanca a 10 de Noviembre
de 2009.









Fdo. Dra. Martha E. Trujillo Toledo Fdo. Dr. Eustoquio Martínez Molina
ÁNGEL DOMÍNGUEZ OLAVARRI CATEDRÁTICO DE MICROBIOLOGÍA Y
DIRECTOR DEL DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGÍA Y GENÉTICA DE LA
UNIVERSIDAD DE SALAMANCA,



CERTIFICA:



Que la memoria titulada AVANCES EN LA SISTEMÁTICA DEL GÉNERO
Micromonospora: ESTUDIO DE CEPAS AISLADAS DE RIZOSFERA Y NÓDULOS
DE Pisum sativum presentada por Lorena Carro García para optar al grado de Doctor
por la Universidad de Salamanca, ha sido realizada bajo la dirección de la Dra. Martha
E. Trujillo Toledo y del Dr. Eustoquio Martínez Molina en el Departamento de
Microbiología y Genética de la Universidad de Salamanca.






Y para que así conste, expido y firmo el presente certificado en Salamanca a 10 de
Noviembre de 2009.





Fdo. Ángel Domínguez Olavarri.
































Con mi más sincero agradecimiento a todas aquellas personas que han colaborado, de una forma u
otra, a que este trabajo llegara a buen puerto.


ÍNDICE
1. INTRODUCCIÓN.................................................................................................... 5
1.1. Las leguminosas ............................................................................................... 5
1.2. El guisante (Pisum sativum)............................................................................. 6
1.2.1. Botánica.................................................................................................... 6
1.2.2. Clasificación taxonómica ......................................................................... 8
1.2.3. Desarrollo radicular y nodulación ............................................................ 9
1.2.4. El guisante como alimento ..................................................................... 11
1.3. Actinobacterias ............................................................................................... 12
1.4. Micromonospora............................................................................................. 13
1.4.1. Clasificación taxonómica ....................................................................... 15
1.4.2. Hábitat .................................................................................................... 18
1.4.3. Importancia del género ........................................................................... 19
1.5. Interacción planta-microorganismo................................................................ 20
1.6. Biodiversidad y Taxonomía. .......................................................................... 24
1.6.1. Métodos de tipado para el estudio de la biodiversidad........................... 24
1.6.2. Avances en la taxonomía de procariotas ................................................ 27
2. OBJETIVOS........................................................................................................... 42
3. MATERIALES Y MÉTODOS............................................................................... 44
3.1. Preparación y análisis del entorno de aislamiento de los microorganismos... 44
3.2. Aislamiento de microorganismos ................................................................... 45
3.2.1. Microorganismos aislados a partir de nódulos ....................................... 45
3.2.2. Microorganismos aislados a partir de la rizosfera.................................. 46
3.3. Mantenimiento y conservación de las cepas................................................... 46
3.4. Diversidad genética de los microorganismos aislados ................................... 47
3.4.1. Microorganismos utilizados en el estudio de diversidad genética ......... 47
3.4.2. Recogida de células ................................................................................ 47
3.4.3. Extracción de ADN ................................................................................ 48
3.4.4. Perfiles de BOX-PCR............................................................................. 49
3.4.5. Perfiles de Microsatélites........................................................................ 50
3.4.6. Perfiles de TP-RAPD ............................................................................. 51
3.4.7. Perfiles de ARDRA ................................................................................ 52
3.4.8. Separación de los fragmentos amplificados ........................................... 53
3.4.9. Análisis de los resultados ....................................................................... 54
3.4.10. Análisis de escalado multidimensional................................................... 54
3.5. Análisis multilocus de los microorganismos.................................................. 55
3.5.1. Microorganismos utilizados en el análisis multilocus............................ 55
3.5.2. Obtención de ADN genómico ................................................................ 55
3.5.3. Preparación de las muestras para su amplificación ................................ 58
3.5.4. Secuenciación del gen ribosómico 16S .................................................. 58
3.5.5. Secuenciación del gen que codifica la subunidad B de la girasa (gyrB) 60
3.5.6. Secuenciación del gen que codifica una recombinasa (recA) ................ 61
3.5.7. Secuenciación del gen que codifica la subunidad B de la ARN
polimerasa (rpoB)................................................................................... 62
3.5.8. Secuenciación del gen que codifica la subunidad ß de la atp sintetasa
(atpD) 63
3.5.9. Separación de los fragmentos amplificados ........................................... 63
3.5.10. Purificación de los productos de PCR .................................................... 64
3.5.11. Secuenciación automática de los productos de PCR.............................. 65
3.5.12. Análisis de los fragmentos secuenciados ............................................... 66
1
3.6. Estudios de hibridación ADN-ADN............................................................... 67
3.6.1. Extracción de ADN para la hibridación ................................................. 67
3.6.2. Hibridación ADN-ADN ......................................................................... 69
3.7. Estudio de quimiotaxonomía.......................................................................... 71
3.7.1. Microorganismos utilizados en el análisis quimiotaxonómico............... 71
3.7.2. Recogida de células ................................................................................ 71
3.7.3. Estudio de isómeros del ácido diaminopimélico (DAP) ........................ 72
3.7.4. Contenido en azúcares celulares totales ................................................. 73
3.7.5. Composición del perfil de menaquinonas .............................................. 74
3.7.6. Ácidos grasos.......................................................................................... 75
3.7.7. Lípidos polares ....................................................................................... 76
3.8. Estudios de fisiología ..................................................................................... 79
3.8.1. Microorganismos estudiados