Recombinant expression, purification and characterization of human hyaluronidases [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Edith Hofinger

Recombinant Expression,
Purification and Characterization
of Human Hyaluronidases




Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)
der Naturwissenschaftlichen Fakultät IV – Chemie und Pharmazie –
der Universität Regensburg












vorgelegt von
Edith Hofinger
aus Regenstauf

2007

































Die vorliegende Arbeit entstand in der Zeit von April 2003 bis März 2007 unter der Leitung
von Herrn Prof. Dr. A. Buschauer und Herrn Prof. Dr. G. Bernhardt am Institut für Pharmazie
der Naturwissenschaftlichen Fakultät IV – Chemie und Pharmazie – der Universität
Regensburg.




















Das Promotionsgesuch wurde eingereicht im März 2007.

Tag der mündlichen Prüfung: 30. März 2007

Prüfungsausschuss: Prof. Dr. S. Elz (Vorsitzender)
Prof. Dr. A. Buschauer (Erstgutachter) G. Bernhardt (Zweitgutachter) Dr. R. Gschwind (Prüfer)





























“It doesn't matter if you fall down as long as you pick something up from the floor when you
get up.”
Efraim Racker


Danksagung


An dieser Stelle möchte ich mich bedanken bei:

Herrn Prof. Dr. A. Buschauer für die Möglichkeit an diesem interessanten Projekt arbeiten zu
dürfen sowie für seine wissenschaftlichen Anregungen und seine konstruktive Kritik bei der
Durchsicht dieser Arbeit.

Herrn Prof. Dr. G. Bernhardt für seine wissenschaftliche Anleitung, seine stetige
Unterstützung beim Lösen experimenteller Probleme, sein Interesse am Fortgang der
Experimente und für die kritische Durchsicht dieser Arbeit.

Herrn Prof. Dr. Rudolph (Institut für Biotechnologie, Martin-Luther Universität Halle-
Wittenberg) für die Bereitstellung der Top10 und BL21(DE3)RIL Bakterien und des pET15b
Vektors, für viele fachlichen Ratschläge sowie für die Möglichkeit im August/September
2004 in seiner Arbeitsgruppe Proteinfaltungsversuche durchzuführen.

Herrn Prof. Dr. M. Stubbs und Frau B. Epler (Institut für Biotechnologie, Martin-Luther
Universität Halle-Wittenberg) für die Durchführung der Kristallisationsexperimente.

Herrn Dr. habil. H. Lilie (Institut für Biotechnologie, Martin-Luther Universität Halle-
Wittenberg) für die Messung und Auswertung der analytischen Ultrazentrifugation und der
CD-Spektren.

Frau Prof. Dr. Männel und Frau V. Runza (Lehrstuhl für Immunologie, Medizinische
Fakultät, Universität Regensburg) für die Bereitstellung der DS-2 Zellen, des pCoHygro
Vektors und des pMT/BiP/V5-HisA Vektors.

Herrn Dr. J. Oschmann für seine engagierte Betreuung während der Fermentation und der
Faltungsexperimente am Institut für Biotechnologie, Martin-Luther Universität Halle-
Wittenberg.

Frau S. Bollwein für die zuverlässige Durchführung der CE-Analytik.

Herrn Dr. H.-J. Wittmann für die Entwicklung der Programme zur Berechnung der
Fragmentverteilungen.

den Mitarbeitern der analytischen Abteilung der Fakultät für die Aufnahme von ESI-
Massenspektren.

der Arbeitsgruppe von Herrn Prof. R. Deutzmann (Fakultät für Biochemie, Genetik und
Mikrobiologie, Universität Regensburg) für die N-terminale Peptidsequenzierung.

Herrn M. Jedrzejas für die Bereitstellung der pdb-Datei der Modellstruktur des human Hyal-1.

Frau M. Luginger und Frau S. Heinrich für die Hilfe bei allen organisatorischen Fragen.

Peter Richthammer für seine stets gutgelaunte Unterstützung bei technischen Problemen aller
Art.
Frau Dr. J. Hoechstetter und Herrn Dr. A. Botzki für die Einführung in das Hyaluronidase-
Thema.

meinen studentischen Hilfskräften Sabine Weitensteiner, Christian Muhr und Erika Martina
für ihre engagierte Mitarbeit im Labor.

meinen Laborkollegen Christine Müller, Lydia Schneider und Erich Schneider für ihre
Hilfsbereitschaft und die heitere Atmosphäre im Labor.

allen Mitgliedern des Lehrstuhls für ein hervorragendes Arbeitsklima.

meinen Kollegen und Freunden Manuela Menke, Hendrik Preuss, Ralf Ziemek, Stephan
Braun, Martin Spickenreither, Christian Horn, Christine Müller und Patrick Igel für viele
anregende Diskussionen, aber auch für eine unterhaltsame und fröhliche Zeit in Regensburg.

dem Graduiertenkolleg 760 der DFG für die finanzielle und wissenschaftliche Förderung.

allen meinen Freunden und meiner Familie, auf deren Unterstützung ich mich jederzeit
verlassen konnte.









Contents

Contents


1. Introduction.................................................................................................. 1
1.1. Hyaluronic acid........................................................................................................ 1
1.1.1. Structure and properties ..................................................................................... 1
1.1.2. Occurrence and metabolism............................................................................... 4
1.1.3. Physiological and pathophysiological role of hyaluronan ................................. 5
1.2. The six human hyaluronidase subtypes ................................................................. 6
1.2.1. Properties of mammalian hyaluronidases .......................................................... 7
1.2.2. Structural features and catalytic mechanism of human hyaluronidases............. 8
1.2.3. Subtype specific differences............................................................................. 11
1.2.4. Relevance of hyaluronidases in the development of cancer ............................ 13
1.3. References............................................................................................................... 14

2. Scope and objectives................................................................................... 21

3. Heterologous expression of the human hyaluronidases PH-20, Hyal-1,
Hyal-2 and Hyal-4 in bacteria ................................................................... 23
3.1. Introduction............................................................................................................ 23
3.2. Materials and Methods .......................................................................................... 25
3.2.1. Enzymes, chemicals and standard techniques.................................................. 25
3.2.2. Amplification of hyaluronidase cDNAs by PCR ............................................. 25
3.2.3. Overlap extension PCR of hyal-4 cDNA ......................................................... 27
3.2.4. Restriction digest and ligation of PCR fragments and pET15b ....................... 28
3.2.5. Generation of competent E. coli cells .............................................................. 29
3.2.6. Transformation of competent E. coli................................................................ 29
3.2.7. Colony PCR for the selection of positive clones.............................................. 29
3.2.8. Preparation of plasmid DNA from E. coli........................................................ 30
3.2.9. Overnight cultures, glycerol stocks and LB-agar plates .................................. 31
3.2.10. Agarose gel electrophoresis............................................................................. 31
3.2.11. Hyaluronidase expression in E. coli BL21(DE3)RIL....................................... 31
TM3.2.12. Hyaluronidase expression in Rosetta-gami (DE3)........................................ 32
3.2.13. Separation of soluble and insoluble cell fractions............................................ 32
33 3.2.14. Discontinuous SDS-PAGE...............................................................................
3.2.15. Turbidimetric hyaluronidase activity assay...................................................... 33
3.2.16. Colorimetric hyaluronidase activity assay ....................................................... 34


I Contents
3.3. Results and Discussion........................................................................................... 34
3.3.1. Analysis of hyaluronidase cDNA sequences ................................................... 34
3.3.2. Construction of pET15b/ph-20, pET15b/hyal-1 and pET15b/hyal-2 .............. 35
3.3.3. hyal-4 expression vectors by overlap extension