Physiological, genetic and molecular analysis of two Arabidopsis mutants with defects in normal development [Elektronische Ressource] / vorgelegt von Rana Pooraiiouby

Physiological,eneticndolecularnalysisfwo
Arabidopsisutantsithefectsnormal
development

Vonerakultätürathematik,nformatikndaturwissenschaftener
RheinischWestfälischenechnischenochschuleachenur
Erlangungdeskademischenradesinesoktorser
Naturwissenschaftenenehmigteissertation



vorgelegtvon

Masterfscience
Ranaooraiiouby
Ausabriz,ran




Berichter:niversitätsprofessorr...lusarenko
Privatdozentr..L.chlaich





Tageründlichenrüfung:1.10.2008
Dieseissertationstufennternetseitenerochschulbibliotheknlineerfügbar
InstituteoriologyIIPlanthysiology)
RHEINISCHWESTFÄLISCHETECHNISCHEHOCHSCHULEAACHEN


PhDhesis
Physiological,eneticndolecularnalysisfwo
Arabidopsisutantsithefectsnormalevelopment


Presentedy
MasterfScience
RanaoorAiiouby


Scientificupervision
UniversityProfessorDr..lusarenko
Dr.ikolaschlaich

Aachen,ctober008



II
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Im Gegensatz zu tierischen Zellen, haben Pflanzenzellen eine feste Zellwand und können sich
deswegennichtbewegen.Sosindsienachder ZellteilungfesteingebettetinihrerrelativenPosition
zudenNachbarnzellen.DaheristdieOrienti erungderZellteilungsebenekritischfüreinenormale
Pflanzenorganmorphogenese. Kortikale Mikrotubuli (MT) spielen eine wichtige Rolle in diesem
VorgangindemsiediePräprophasebande(PPB).Nachder MitosebildetsicheineneueZellwand
währendderZellteilunginderEbenezwischendenzweiTochterzellen.DerPhragmoplast,eine
weitereStruktur,dieMTbeinhaltet,bildeteineEbenezwischendenzweiTochterzellkernenausund
anihmwirddieneueZellwandabgelagert.MTkommtbeiderFestlegungdesPflanzenwuchshabitus
eineweitereRollezu,daMTwichtigfürdieparalleleAusrichtungvonZellulosemikrofibrilleninder
Zellwand sind. So bestimmen die MTuster das Muster der Zellulosemikrofibrillen auf der
Außenseite der Plasmamembran. Die Ausrichtung der Zellulosemikrofibrillen hat wiederum
Auswirkungen auf die Flexibilität der Zellwand und kontrolliert die Richtung des
Zellexpansionswachstums. Pflanzenzellen werden durch pektische Polysaccharide, die
Polygalakturonsäureenthalten,miteinanderverbundenu ndPektinisteinBestandteilderMatrix,die
dieZellulosemikrofibrillenumgibt.SomitkommtMTund pektischenPolysaccharideneineaktiveund
wichtigeolleeierusprägunger ellundrg anmorphologieu.
WährendderSelektionvontransgenen ArabidopsisLinienfielenzweiMutantenauf,dieinteressante
PhänotypenaufwiesenundwurdenausgewähltfürweitereUntersuchungen.IndereinenMutante
wareinGendefekt,dasfüreinEnzymkodiert,dasimMetabolismusvonpektischenPolysacchariden
beteiligtist(“ pgase”).DieandereMutante(“ bushyff ”)hatteTDNAInsertioneninzweiGenen:eine
ineinemGen,dasbekanntermaßenAuswirkungenaufdieMTOrganisationhatunddieanderein
einemenitnbekannterunktion.
InmeinerDoktorarbeitcharakterisierteichdiesebeidenMutanten.ImSpezifischengingichdie
folgendenragenn:
Wasindieorphologischen undnatomischenefekteiner pgase”utante?
itLichtundRasterelektronenmikroskopiekonnteichzeigen,dassdiePflanzeimDurchmesserund
derHöhereduziertwarunddassdieBlätteretwasunebenwaren.BeidenGewebenwarendie
auffallendstenDefekte,dassdieZahlderTrichomeumca.30%verringertwarundauchdieAnzahl
derchließzellenerpaltöffnungenmerglei chuemildtyperringertar.
WasarieolekulareUrsacheieserutante?
Thermalasymmetricinterlaced(=TAIL)PCRzeigteeineTNAInsertionineinemMitgliedderFamilie
derPolygalakturonasenvon Arabidopsis,At3g07970.SemiuantitativeRTCRzeigteeineungefähr
umFaktor3verringerteExpressionvonAt3g07970inder“ pgase”MutanteimVergleichzumWildtyp.
KomplementationderPhänotypender“ pgase”MutantedurchÜberexpresssiondes“ PGase”Gens

I


Zusammenfassung
und Untersuchungen an einer weiteren TNA Insertionsmutante im At3g07970 Gen, die
morphologischePhänotypenaufwies,diesichnicht vondenenderursprünglichen„ pgase“Mutante
unterschieden,eigten,assieseutationerantw ortlichürieeobachtetenhänotypenar.
ZellwändesindwichtigeBarrierenfürbiotischeundabiotischeStressoren.DadieMutationineinem
“PGase”GenwahrscheinlichzuVeränderungeninderZellwandführtuntersuchteichdieAntwortder
“pgase”MutanteaufbiotischenundabiotischenStress. DafürwurdedieMutanteeinerInfektionmit
Hyaloperonosporaarabidopsidis,Kälte,HitzeundTrockenstr essausgesetzt.Wirfandendassdiese
Mutanterhöhtnfälligegenüberernfektionit H.rabidopsidis ,ältenditzetressar.
Folgenderagenurdenner? bushyff ”utanteuntersucht:
Wasindieorphologishennd natomischenefektener? bushyf ”utante?
Mit dem Licht und Rasterelektronenmikroskop fanden wir, dass alle Organe einschließlich der
Wurzeln,BlätterundBlütenabnormalindieserMutantewaren.Die“ bushyf ”Pflanzenwarenin
allenDimensionenstarkkomprimiert.Aufder GewebeundZellebenewurdenverschiedeneDefekte
beobachtet,z.B.warendieWurzelzellender“ bushyf ”Pflanzenum~30%kleineralsdievonCol
Wurzelzellen, die Zahl der Trichome war ungefähr halbiert, die Verzweigung der Trichome war
verändert und die Differenzierung des Mesophylls in Schwamm und Palisadenmesenchym war
fehlerhaft.
WasarieolekulareUrsacheieserutante?
hermalasymmetricinterlaced(=TAIL)PCRzeigtezweiunabhängigeTNAInsertionen,eineim
Promotereinesbisdatouncharakterisierten Fbox Gens(At1g77000)undeineweitereimPromoter
desbereitsalskortikaleMTorganisierendenbekannten FASSGens(At5g18580).MolekulareAnalysen
wiesenaufeineimVergleichzumWildtypum50%reduzierteExpressionder FASSand Fox Gene
hin.
In Linien, in denen entweder Fox oder FASS konstitutiv im “ bushyf ” Mutanten Hintergrund
exprimierturden,urdeeobachtet,dass neidenällenie eobachteten“ bushyf ”hänotypen
komplementiertwurden.Dieslegtnahe,dassdie MutationeninbeidenGenengleichzeitigvorhanden
seinmuss,umdie“ bushyf ”MutantenPhänotypenhervorzurufen.GenetischeExperimente,die
Kreuzungenvon“ bushyff”mitWildtypsowieKreuzungenzwischenEinzelgenMutantenin fox und
fassMutantenbeinhalteten,bestätigten,dass beideMutationenauftreten musstenundausreichend
warenüren bushyf ”hänotyp.
DasGewebespezifischeExpressionsmustervon Fox and FASSzeigte,dassbeideGeneaufungefähr
gleichemNiveauinallengetestetenGewebenexprimiertwurdenberuhtdiegenetischeInteraktion
zwischenem Fbox ndem FASSenufinerhysikalischennteraktion?

II









Zusammenfassung
Mittels dem Hefeweiybrid Systems konnten wir zeigen, dass Fox und FASS Proteine
miteinanderinteragierten.
Wonerflanzenzellei ndetichas oxrotein?
TransgeneLinien,diekons titutiveineFusionausFoxundGrünluoreszierendemProtein(GFP)im
“bushyf ” Mutanten Hintergrund exprimierten (35S:: Fox FP), zeigten eine intrazelluläre
VerteilungvonFboxProtein,diesehrähnlichzuderVerteilungeinesMTssoziiertenProteinswar
(GFPTUA6).
ZusammengefasstlegenunsereDatennahe,dassFASSkortikaleMTorganisierenkönntemittelsder
Interaktionitemoxrotein.










III



SUMMARY
SUMMARY
Unlike animal cells, plant cells have a rigid wall and hence cannot migrate. Rather, they are
permanentlyfixedintheirrelativepositiontoneighbourin gcellsaftercelldivision.Therefore,for
normal plant organ morphogenesis the orientation of the cell division plane is critical. Cortical
microtubules (MTs) play an important role in this process by forming a structure called the
preprophaseband(PPB).Aftermitosis,anewcellwallisformedduringcytokinesisintheplane
betweenthetwodaughterce lls.Thephragmoplast,anotherstructurecontainingMTs,formsinthe
planeetweenhewoaughterucle iandaysownheewel lall.
AfurtherroleforMTsindeterminingplantstature stemsfromthefactthatMTsareimportantfor
theparalleldepositionofcellulosefibresinthecellwall.Thus,thepatternsformedbytheMTsdirect
the patterning of cellulose microfibrils on the outer side of the plasma membrane. Cellulose
microfibrilorientationhasconsequencesoncellwallflexibilityandcontrolsthedirectionofcell
expansionrowth. Plant cells are cemented toget her by pectic polysaccharides containing
polygalacturoniccid,ndectinsao mponentf theatrixurroundingheelluloseicrofibrils.
Thus,MTsandpecticpolysaccharidesplayanactive andimportantroleinestablishingcellandorgan
morphology.
Intheprocessofselecting Arabidopsistransgeniclinestwomutantswerenoticedwithinteresting
phenotypesandthesewereselectedforfurtherstudy.Inonemutantagenecodingforanenzyme
involvedinpecticpolysaccharidemetabolismwasaffected(“ pgase”)andtheothermutant(“ bushy
ff”)hadTNAinsertionsintwogenes:oneinageneknowntoaffectMTorganizationandtheother
ineneofnknownfunction.
Duringyhesisharacterizedhoseutants.pe cificallyddressedheollowingspects:
Whatreheorphologicalndnat omicalefectsinhe pgase”utant?
singlightandscannin gelectronmicroscopy,itwasshownthat thetotalsizeoftheplantin
diameterndeightaseduced ndtheeavesereomewhattwisted. theissueevelthemost
obviousdefectswerethe~30%decreasednumberof thetrichomesandreducednumberofthe
epidermaluardellsnomparisonoildypelants.
Whatasheolecularasisfthisutant?
Thermal asymmetric interlaced (=TAIL) PCR showed a TNA insertion in the Arabidopsis
polygalacturonase(PGase)familymember,At3g07970. SemiuantitativeRTCRshoweda~3old