NMR-based structural and dynamical studies on non-native variants of hen egg white lysozyme [Elektronische Ressource] / von Christian Schlörb

NMR-based Structural and Dynamical
Studies on Non-Native Variants
of Hen Egg White Lysozyme
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades
der Naturwissenschaften
vorgelegt beim
Fachbereich Biochemie, Chemie und Pharmazie
der Johann Wolfgang Goethe-Universität
in Frankfurt am Main
von
CHRISTIAN SCHLÖRB
aus Schotten
Frankfurt am Main
2007
(D30)Vom Fachbereich Biochemie, Chemie und Pharmazie der
Johann Wolfgang Goethe-Universität als Dissertation angenommen.
Dekan: Prof. Dr. Harald Schwalbe
Gutachter: Prof. Dr. und Prof. Dr. Volker Dötsch
Datum der Disputation: 14. November 2007Die schönste Erfahrung, die ein Mensch machen kann, ist die Verzauberung! Sie ist
dieQuelleallerwahrenKunstundWissenschaft.WemdiesesGefühlfremdist,wernicht
mehrstaunendinnehaltenkannundinEhrfurchtverharrenkann,deristeigentlichschon
tot, dessen Augen sind blind!
- Albert Einstein -ivTable of Contents
List of Figures ix
List of Tables xiii
List of Abbreviations xv
Preface xvii
Abstract xix
1. Introduction 1
1.1. Protein folding and non-native states of proteins . . . . . . . . . . . . . 1
1.1.1. Overview . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.1.2. The investigation of protein folding and non-native states of
proteins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.2. Background: Nuclear magnetic resonance spectroscopy . . . . . . . . . 10
1.2.1. Overview . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
1.2.2. NMR parameters utilized in this thesis . . . . . . . . . . . . . . 12
1.3. Hen egg white lysozyme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
1.4. Motivation and aims . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
2. Materials and Methods 35
2.1. Sample preparation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
2.1.1. Overview . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
2.1.2. Expression and purification . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
2.1.3. S-Methylation of cysteine residues . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
2.1.4. Site-directed mutagenesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
2.1.5. Biochemical analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
2.1.6. NMR samples . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
2.2. Backbone resonance assignment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
2.2.1. Overview . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
vTableofContents
2.2.2. Acquisition of two- and three-dimensional spectra and sequen-
tial backbone assignment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
2.3. Assignment of tryptophan side chains . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
2.3.1. General assignment strategy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
2.3.2. The HN(CACB)CG experiment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
2.3.3. The HN(CD)CG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
2.4. Photo-CIDNP experiments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
2.5. Protein Dynamics . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
2.5.1. Heteronuclear relaxation rates . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56
2.5.2. Relaxation dispersion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
2.6. Residual dipolar couplings . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
2.6.1. Experimental determination of RDCs . . . . . . . . . . . . . . . 58
2.6.2. Simulation of RDCs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
2.7. Residual structure in organic solvents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
3. Results and Discussion 63
3.1. Sample preparation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
3.2. Backbone resonance assignment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
3.3. Chemical shift analysis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
3.4. Assignment of tryptophan side chains . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
3.5. Photo-CIDNP experiments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
15 13.5.1. Two-dimensional N- H photo-CIDNP . . . . . . . . . . . . . . 77
13 13.5.2. T C- H . . . . . . . . . . . . . . 81
3.6. Protein dynamics by heteronuclear relaxation . . . . . . . . . . . . . . . 83
3.7. Residual dipolar couplings . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90
3.8. structure in organic solvents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96
3.9. Conclusions and outlook . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 104
A. Appendix 107
A.1. List of buffers, media and primers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
A.1.1. M9 minimal media . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 107
A.1.2. Protein purification buffers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108
A.1.3. Primer for site-directed mutagenesis . . . . . . . . . . . . . . . . 108
A.2. NMR aquisition and processing parameters . . . . . . . . . . . . . . . . 109
A.3. Resonance assignments . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111
MeA.3.1. HEWL-S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111
A.3.2. all-Ala-HEWL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115
viTableofContents
A.3.3. W62G- and W108G-all-Ala-HEWL . . . . . . . . . . . . . . . . . 119
A.4. Heteronuclear relaxation rates . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 123
A.5. Residual dipolar couplings . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 129
A.6. Pulse programs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133
15 1A.6.1. The 2D N- H photo-CIDNP pulse program . . . . . . . . . . . 133
13 1A.6.2. The 2D C- H pulse program . . . . . . . . . . . 136
A.6.3. The HN(CACB)CG pulse program . . . . . . . . . . . . . . . . . 139
A.6.4. The HN(CD)CG pulse program . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144
B. References 149
Zusammenfassung 171
Danksagung 177
Curriculum Vitae 179
List of Publications 181
viiviiiList of Figures
1.1. Schematic representation of the folding funnel . . . . . . . . . . . . . . 2
1.2. Overview of protein folding and misfolding in cells . . . . . . . . . . . 3
1 151.3. H- N-HSQC spectra of refolded HEWL and all-Ala-HEWL . . . . . . 13
1.4. Photo-CIDNP of proteins . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
1.5. cycle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
1.6. Orientation of a bond vector relative to the magnetic field B and the0
molecular frame . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
1.7. Schematic representation of a bond vector in the principal axis system 19
1.8. Distribution of RDC values for the possible orientations . . . . . . . . . 20
1.9. Time-scales of molecular motions and NMR-techniques . . . . . . . . . 23
1.10. Dependence of R , R and the heteronuclear NOE on the on the over-1 2
all rotational correlation time . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
151.11. Dependence of N R heteronuclear relaxation rates on the correla-2
tion times for global and internal motions and the order parameter
from a model-free approach . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
1.12. NMR structure of native hen egg white lysozyme . . . . . . . . . . . . 28
1.13. Distribution of hydrophobicity in HEWL . . . . . . . . . . . . . . . . . 29
15 Me1.14. N R relaxation rates in HEWL-S and single point mutants of2
MeHEWL-S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
1.15. Conformations with the amino acid sequence of HEWL randomly
chosen to represent distinct radii of hydration (R ) . . . . . . . . . . . . 32h
2.1. Backbone resonances assignment experiments for (non-native) pro-
teins (I) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43
2.2. Backbone resonances assignment experiments for (non-native) pro-
teins (II) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
2.3. Backbone resonances assignment experiments for (non-native) pro-
teins (III) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
2.4. Assignment strategy for the tryptophan side chain resonances . . . . . 46
ixListofFigures
2.5. Pulse sequence of the HN(CACB)CG experiment . . . . . . . . . . . . . 51
2.6. Pulse of the HN(CD)CG . . . . . . . . . . . . . . 52
2.7. Pulse sequence of the 2D photo-CIDNP experiment . . . . . . . . . . . 53
2.8. Laser set-up for photo-CIDNP experiments . . . . . . . . . . . . . . . . 54
2.9. Riboflavin 5’-mononucleotide (FMN) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
3.1. SDS polyacrylamide gel after inclusion body washing and solubilization 64
3.2. SDS gel after ion exchange chromatography . . . . . . 64
1 153.3. H- N-HSQC spectra of refolded HEWL and all-Ala-HEWL . . . . . . 65
3.4. Sequential backbone resonance assignment using the HNCACB ex-
periment . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
3.5. Sequential backbone resonance assignment using the HNN experiment 68
1 153.6. Annotated H- N-HSQC spectrum of all-Ala-HEWL . . . . . . . . . . 70
1 133.7. Secondary chemical shift plots for H and C of all-Ala-HEWL . . . 72a a
3.9. Results of the assignment strategy for the tryptophan side chain in-
dole resonances . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .