Microarray based real-time analysis of nucleic acid hybridization kinetics and thermodynamics [Elektronische Ressource] / Siegfried Krainer
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01 janvier 2011
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12
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Poids de l'ouvrage
3 Mo
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Microarray based real-time analysis of nucleic
"
acid hybridization kinetics and
thermodynamics\
Dissertation
Zur Erlangung des Grades
Doktor der Naturwissenschaften
Am Fachbereich Biologie
Der Johannes Gutenberg-Universitat Mainz
DI Siegfried Krainer
geb. am 21.01.1968 in Friesach/Osterreich
Mainz, 2011Contents
Contents i
List of Figures v
List of Tables vii
1 Introduction 7
1.1 Motivation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.2 The topic . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.3 Organization of the content . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
2 Physical chemistry of nucleic acid hybridization 9
2.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
2.2 Building blocks of DNA and RNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
2.2.1 D-Ribose: Determining structure and chirality . . . . . . . . . . . . . . . 10
2.2.2 Sugar pucker and nucleic acid structure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
2.2.3 Locked nucleic acid (LNA) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
2.2.4 Bases: The letters of the genetic code . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
2.2.5 Interaction between bases . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
2.2.6 The phosphate backbone . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.2.7 Structural parameters of nucleic acids . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.2.8 Base opening in RNA and DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
2.2.9 In uence of the C5-methyl group . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21
2.3 Charge distribution of bases . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
2.3.1 Protonation and ionization of Nucleic Acid bases . . . . . . . . . . . . . . 25
2.3.2 Calculation of the ground state charge distribution . . . . . . . . . . . . . 25
2.3.3 The interaction with ionic solution . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25
2.4 Physical characterization of nucleic acids . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
2.4.1 Physics of biopolymers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
2.4.2 Parameters characterizing biopolymers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28
2.5 Physical chemistry of hybridization . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
2.5.1 Immobilization chemistry on aldehyde surfaces . . . . . . . . . . . . . . . 30
2.5.2 of DNA on bare glass . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31
2.6 Physics of online hybridization measurement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
2.6.1 Probe density on microarrays . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
2.6.2 Target and dye concentration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
iii CONTENTS
2.6.3 Hybridization e ciency . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34
2.6.4 Absorption of the incoming photons . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
2.6.5 Emission intensity of the uorophores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
2.6.6 In uence of photobleaching . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
2.6.7 of the optics . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
2.6.8 Confocal online measurement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
2.6.9 E ciency of an EM-CCD camera . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37
2.6.10 Quantitiative description of online measurment . . . . . . . . . . . . . . . 37
2.7 Summary . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
3 Thermodynamics of hybridization 41
3.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
3.2 Parameters in uencing melting temperature . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
3.2.1 Oligonucleotide length and sequence . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
3.2.2 Salt concentration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
3.2.3 Oligonucleotide concentration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
3.2.4 Denaturating Agents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
3.2.5 In uence of metal ions on nucleic acid hybridization . . . . . . . . . . . . 43
3.2.6 Simple formulas for T . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44m
3.3 Thermodynamic of Hybridization . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
3.3.1 Theory of the two-state model . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
3.3.2 Temperature dependence of thermodynamic properties . . . . . . . . . . . 47
3.3.3 Solution based results . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
3.4 The Nearest Neighbor model . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
3.4.1 Parameters of the NN model . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
3.4.2 Gibbs free energy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
3.4.3 Comparison of NN results with simple formulas . . . . . . . . . . . . . . . 51
3.4.4 Extraction of NN parameters from experimental data . . . . . . . . . . . 54
3.4.5 The in uence of mismatches . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
3.4.6 In uence of probe length on melting analysis . . . . . . . . . . . . . . . . 55
3.5 Thermodynamic changes during . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
3.5.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
3.5.2 Calorimetric parameters of DNA melting . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
3.6 Thermodynamics of DNA RNA hybrids . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
3.6.1 Structure and thermodynamics of DNA RNA duplexes . . . . . . . . . . 60
3.7 Thermodynamic of surface adsorption . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
3.7.1 The Langmuir theory of adsorption . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
3.7.2 Is Microarray hybridization a Langmuir process? . . . . . . . . . . . . . . 61
3.8 Publication: Solid phase high resolution melting . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
3.8.1 Abstract . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
3.8.2 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
3.8.3 Materials and Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
3.8.4 Results and discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
3.8.5 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
3.8.6 Acknowledgement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69
4 Kinetic of Nucleic Acid Hybridization 71
4.1 Di usion of nucleic acid molecules . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
4.1.1 In uence of DNA length on mobility . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
??CONTENTS iii
4.1.2 Estimation of the di usion coe cient of DNA . . . . . . . . . . . . . . . . 72
4.1.3 Di usion coe cient in solution and in cytoplasm . . . . . . . . . . . . . . 73
4.1.4 Temperature behavior of di usion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
4.2 Physics of di usion-reaction systems . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
4.2.1 Is DNA hybridization di usion or reaction controlled? . . . . . . . . . . . 74
4.3 Solution based results for hybridization . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
4.4 Numerical solution of di usion-reaction equation . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
4.4.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
4.4.2 The di usion equation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
4.4.3 Finite-di erence algorithm for di usion equation . . . . . . . . . . . . . . 78
4.4.4 Crank-Nicolson in one dimension . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
4.4.5 algorithm in two dimension . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
4.4.6 in cylinder coordinates . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
4.4.7 Modeling of denaturation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
4.5 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
5 Algorithms and modeling tools 83
5.1 DNA hybridization as a Fermi-Dirac system . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
5.1.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
5.1.2 Fermi-Dirac algorithm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
5.1.3 Experimental data . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
5.2 Modeling with ChipCheckII . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85
5.3 Publication: Physical model based algorithm . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
5.3.1 Abstract . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
5.3.2 Background . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89
5.3.3 Methods . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90
5.3.4 Results and discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
5.3.5 Kinetic analyis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
5.3.6 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
5.3.7 Competing interests . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
