Projet de thèse
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Université Paris-Sud 11, Projet proposé à l’ED 425 « Innovation thérapeutique, du fondamental à l’apliqué » Faculté de Pharmacie UPRES JE 2493 Titre « Dynamique des microtubules « Etude des relations entre la structure du en Physiopathologie" domaine moteur de la kinésine-1 et de Dir. Pr C. Poüs nouveaux inhibiteurs synthèse : application à une nouvelle stratégie thérapeutique anti- cancéreuse » a) Contexte scientifique du projet Il a été montré au laboratoire que l'appareil de Golgi est capable de générer ses propres MTs indépendamment du centrosome à cause de la présence de gamma-tubuline sur la face cytoplasmique des membranes golgiennes (Mol. Biol. Cell, 2001, 12:2047-60). Les MTs issus de l'appareil de Golgi sont plus facilement stabilisés que ceux issus du centrosome. Cette différence résulterait du déplacement vers l’extrémité en croissance des MTs naissants du moteur moléculaire ubiquitaire kinésine-1, qui les protègerait ainsi contre un désassemblage prématuré (Exp. Cell Res., 2005, 304:483-92). Une inhibition de la kinésine-1 obtenue par interférence ARN contre la chaîne lourde du moteur et/ou transfection d'un dominant négatif de la chaîne légère ralentit la croissance et plus globalement la dynamique microtubulaire, sans cependant altérer l'aspect du réseau de MTs. La kinésine-1 régule aussi la dissociation de CLIP-170 de l'extrémité en croissance du MT, mais surtout coopère avec CLIP-170 pour réguler l'assemblage des MTs en réseau. ...
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Université ParisSud 11,Pro etro oséà l’ED 425 « Innovation thérapeutique, du fondamental à l’apliqué » Faculté de Pharmacie UPRES JE 2493 Titre « Dynamique des microtubules « Etudedes relations entre la structure du en Physiopathologie" domaine moteur de la kinésine1 et de Dir. Pr C. Poüs nouveaux inhibiteurssynthèse : application à une nouvelle stratégie thérapeutique anti cancéreuse » a) Contexte scientifique du projet Il a été montré au laboratoire que l'appareil de Golgi est capable de générer ses propres MTs indépendamment du centrosome à cause de la présence de gammatubuline sur la face cytoplasmique des membranes golgiennes (Mol. Biol. Cell, 2001, 12:204760). Les MTs issus de l'appareil de Golgi sont plus facilement stabilisés que ceux issus du centrosome. Cette différence résulterait du déplacement vers l’extrémité en croissance des MTs naissants du moteur moléculaire ubiquitaire kinésine1, qui les protègerait ainsi contre un désassemblage prématuré (Exp. Cell Res., 2005, 304:48392). Une inhibition de la kinésine1 obtenue par interférence ARN contre la chaîne lourde du moteur et/ou transfection d'un dominant négatif de la chaîne légère ralentit la croissance et plus globalement la dynamique microtubulaire, sans cependant altérer l'aspect du réseau de MTs. La kinésine1 régule aussi la dissociation de CLIP170 de l'extrémité en croissance du MT, mais surtout coopère avec CLIP170 pour réguler l'assemblage des MTs en réseau. Ainsi, alors qu'une inhibition de CLIP170 seule inhibe les phénomènes de sauvetage sans affecter l'organisation générale du réseau, une inhibition efficace et simultanée de CLIP170 et de la kinésine1 provoque une rapide altération du réseau de MTs(Daire et al., soumis). Cette coopération des deux protéines suggère que la kinésine1 serait une cible thérapeutique originale dans des cellules dépourvues d'activité CLIP170. Ainsi, dans des tumeurs agressives d’origine épithéliale, les cellules présentent une perte d’expression de la tubulinetyrosine ligase (TTL). La TTL est une enzyme cytosolique qui retyrosyle l’αtubuline préalablement détyrosinée en position Cterminale dans les MTs les plus stables. Or, cette retyrosylation est essentielle pour permettre le recrutement de CLIP170 sur l’extrémité du MT en croissance lors de l’incorporation de nouvelles sousunités de tubuline. La perte de la TTL doit donc entraîner un défaut de recrutement de CLIP170 aux extrémités en croissance des MTs des cellules tumorales.Nous pensons qu’une inhibition efficace de la kinésine1 pourrait altérer sélectivement la dynamique des MTs dans des cellules cancéreuses dépourvues d'activité TTL et perturber en aval leur mitose sans affecter le réseau de MTs des cellules non tumorales.Nous avons par ailleurs montré très récemment que la dynamique des MTs et la kinésine1 sont indispensables pour que les cellules soumises à un stress puissent activer un processus de survie de type autophagique (Geeraert et al., en préparation).Une inhibition de la kinésine1 pourrait donc aussi empêcher des cellules tumorales de survivre à des conditions de stress (hypoxie, stress nutritionnel, stress oxydant, chimiothérapie).Afin de tester nos hypothèses de travail et de valider la kinésine1 comme nouvelle cible thérapeutique potentielle, nous avons besoin de l’inhiber de façon durable et efficace. C’est pourquoi nous avons sélectionné des molécules potentiellement inhibitrices de son activité motrice par criblage virtuel de banques publiques de molécules commerciales. L’arrimage moléculaire de plus de 15000 ligands potentiels sur la structure du domaine moteur de la kinésine1 nous a fourni parmi une quarantaine de ligands potentiels, deux molécules de synthèse naturellement fluorescentes qui se sont montrées efficaces in vivo dans des cellules en culture. Cependant nous ne connaissons ni le site de liaison, ni le mécanisme d’inhibition, ni la spécificité de ces inhibiteurs. Etablir clairement le mode d’action ainsi que le ou les sites de liaison de ces molécules sur le domaine moteur de la kinésine1 est indispensable pour orienter de façon optimale la synthèse d’une petite chimiothèque de molécules dérivées et améliorer l’efficacité et la spécificité de ces inhibiteurs (collaboration avec l’équipe B. Figadère UMR CNRS 8076 BioCIS). Une détermination de la structure du domaine moteur de la kinésine ainsi inhibé sera aussi importante sur le plan cognitif pour mieux comprendre les variations structurales du domaine moteur au cours de son cycle d’hydrolyse de l’ATP et éventuellement ses modalités d’interaction avec la surface du MT. b) Objectifs Les principaux objectifs spécifiques de ce projet de thèse sont donc de
•Affiner par bioinformatique l’estimation du nombre et de la position des sites de liaison des inhibiteurs. Ceci sera effectué par arrimage moléculaire en aveugle sur l’ensemble du domaine moteur de la kinésine1 et sur les autres kinésines dont la structure des domaines moteurs est connue. •Produire et purifier le domaine moteur recombinant de la kinésine1 humaine sauvage et déterminer sa structure tridimensionnelle après liaison des inhibiteurs. Cette étudepermettra de confirmer quels sont les acides aminés importants pour la liaison des inhibiteurs. •En s’appuyant sur la nature fluorescente des inhibiteurs, déterminer expérimentalement le nombre de sites de liaison et leurs constantes de dissociation. •Introduire des mutations sur les régions potentiellement impliquées dans la liaison des inhibiteurs et répéter les analyses structurales. Ces expériences permettront de valider le ou les sites de liaison identifiés et de déterminerin silico, les bases moléculaires d’une éventuelle spécificité d’inhibition. Les résultats seront utilisés pour proposer des modifications chimiques optimales des inhibiteurs qui pourront ensuite être testés in vitro, et in vivo sur des cellules en culture. •Identifier le mécanisme d’inhibition par un test d’accrochage et de motricité in vitro. Ce test permettra, après mise en présence du moteur recombinant, de MTs stabilisés par le Taxol et d’ATP ou d’AMPPNP (un analogue non hydrolysable de l’ATP), de mesurer les paramètres cinétiques de l’hydrolyse d’ATP (par dosage de l’ADP et/ou des phosphates libérés) et de déterminer le type d’inhibition rencontré (compétitif ou non) ainsi qu’une constante d’inhibition. Encadrement, compétences requises, contacts Le (la) candidat(e) évoluera au sein d’une équipe très motivée offrant une expertise allant de la biologie moléculaire et cellulaire à la biologie structurale. Il (elle) pourra se former à différentes techniques: biologie moléculaire, biochimie, expression et purification de protéines, enzymologie, radiocristallographie et bioinformatique. Un profil de biochimiste ou de biologiste moléculaire serait apprécié. Directeur de thèse : Pr Christian Poüschristian.pous@upsud.fr Coencadrement : Dr Pascal Rigoletpascal.rigolet@upsud.fr Tel (33) 1 46 83 54 81 ou (33) 1 46 83 54 78 Fax (33) 1 46 83 58 02 UPRES JE2493 « Dynamique des microtubules en physiopathologie ». Université ParisSud11, Faculté de Pharmacie 5 rue J.B. Clément 92296 ChâtenayMalabry. Bibliographie dans les domaines d’expertise du laboratoire d’accueil en rapport avec le projet ChabinBrion K Marceiller J, Perez F, Settegrana C, Drechou A, Durand G, Poüs C. The Golgi complex is a microtubuleorganizing organelle.Mol. Biol. Cell2001,12:20472060. Daire V, Quesnoit M, Marceiller J, Cantaloube I, Dimitrov A, Perez F, Poüs C. Kinesin1 promotes microtubule assembly and cooperates with CLIP170 to build the interphase microtube network.Soumis. Geeraert C., Bugnard E, Perdiz D, Pattingre S, Rouault A, Ratier A, Codogno P, Poüs C. Autophagosome formation and traffic require cooperation between stable and dynamic microtubules and involve kinesin1. En préparationGuo, R.B., Rigolet, P., Zargarian, L., Fermandjian, S. and Xi, X.G. Structural and functional characterizations reveal the importance of a zinc binding domain in Bloom's syndrome helicase.Nucleic Acids Res.2005,33: 310924. Liu, J.L., Rigolet, P., Dou, S.X.,Wang, P.Y. and Xi, X.G. The zinc finger motif of RecQEscherichia coliis implicated in both DNA binding and protein folding.J. Biol. Chem.2004279; 42794802. Marceiller J Drechou A, Durand G, Perez F, Poüs C Kinesin is involved in protecting nascent microtubules from disassembly after recovery from nocodazole treatment.Exp. Cell Res2005,304:483492. Rigolet, P.Guo, R.B., Ren, H., Zhang, B., Zhang, X.D., Dou, S.X., Wang, P.Y. Structural and functional analyses of diseasecausing missense mutations in Bloom syndrome protein.Nucleic Acids Res. 2007,35: 62976310 Rigolet P., Xi, X.G., Rety, S. and Chich, J.F. The structural comparison of the bacterial PepX and human DPPIV reveals sites for the design of inhibitors of PepX activity.FEBS J.2005,272; 20502059.
