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Cross-linking et méthodes utilisant le cross-linkingCross-linking = établissement d’un pontage covalent entre 2 moléculesCes molécules pouvaient être en interaction « faible »(forces électrostatiques, interaction hydrophobe...),ou dans certains cas simplement à proximité l’une de l’autreMolécules pouvant être cross-linkéesProtéine-protéineProtéine-acide nucléiqueAcide nucléique-acide nucléiqueCross-link protéine-protéineUtilisation d’agent chimique. Exemple 1, imidoester bifonctionnelCross-link protéine-protéineUtilisation d’agent chimique. Exemple 2, DSP(=dithiobis(succinimidyl propionate) = réactif de Lomant)N-hydroxysuccinimide (NHS) à chaque extrémité réagit avec les amines primairesAvantage, le pont disulfure (le même réactif existe aussi sans pont disulfure=DSS)Exemple d’application de cross-link protéine-protéineFIG. 2. Identification of RNA-dependent AUF1 oligomers by protein-protein cross-linking. Bindingreactions containing His6- p37AUF1-(1–257) (5 mM) in the presence or absence of an unlabeled RNA substrate (1.5 mM) were cross-linked with DSP and fractionated by non-reducing SDS-PAGE as described under “Experimental Procedures.” Covalently linked complexes containing AUF1 were thenidentified by immunoblot. The migration positions of protein standards are shown at left.Wilson et al1999 JBC 274, 33374Limites du cross-link protéine-protéineLa réaction de cross-link n’est pas toujours très bien contrôlée.. ...

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Cross-linkinget méthodes utilisant le cross-linkingCross-linking= établissement dun pontagec ovalententre 2 moléculesCes molécules pouvaient être en interaction «faible»(forces électrostatiques, interaction hydrophobe...),ou dans certains cas simplement àproximitélune de lutare

Molécules pouvant être cross-linkéesProtéine-protéineProtéine-acidenucléiqueAcide nucléique-acidenucléique

Cross-linkprotéine-protéineUtilisation dagent chimique. Exemple 1, imidoesterbiofnctionnel

Cross-linkprotéine-protéineUtilisation( =dditahigoebnits (cshuicmciiqniume.i dEyxleprmopplieo n2,a tDe)S =P réactif de Lomant)N-hydroxysuccinimide(NHS) àchaque extrémitéréagit avec les amines primairesAvantage, le pont disulfure(le même réactif existe aussi sans pont disulfure=DSS)

Exemple dapplication de cross-linkprotéine-protéineFIG. 2. Identification ofRNA-dependentAUF1 oligomersby protein-proteincross-linking. BindingreactionscontainingHis6-p37AUF1-(1257) (5 mM) in thepresenceor absence ofan unlabeledRNA substrate(1.5 mM) werecross-linkedwithDSP andfractionatedby non-reducingSDS-PAGE as describedunderExperimentalProcedures.Covalentlynlikedcomplexes containingAUF1 werethenidentifiedby immunoblot. Themigration positions ofproteinstandards are shownatleft.

Limites du cross-linkprotéine-protéineLa réaction de cross-linknest pas toujours très bein contrôlée...Typiquement, le cross-linkpeut se produire entre des moléculesqui sont simplement àproximitélune de lautre

Cross-linkprotéine-acidenucléique1. Utilisation dagent chimique : formaldehydeARN ou ADNRendement élevé, pontage réversible (par chauffage)

Cross-linkprotéine-acidenucléique2. Irradiation aux UVExemple :U tviloiisra TblDe 2é g(carleosmse-lnint kpoAuRr Nd-edsc ipn1t eorua cetiIoFn4sF )ADN-protéineRendement plus faible, pontage irréversibleMais cross-linksouvent plus spécifique (interacteursréels)

Cross-linkacide nucléique-acidenucléiqueIncubation en présence de psoralen(agent intercalant), puis irradiation UV (le psoralenponte les pyrimidines de deux brins dAN différents)(Utilisation médicale : psoriasis, eczémaphotosensibilisation de la peau puis traitement UVA)

Exemple dapplication du cross-linkARN-ARNPurification des complexes spliceosomaux,puis fractionnement par centrifugation surgradient de saccharose

Exemple dapplication du cross-linkARN-ARNFig. 3. CharacterizationofRNARNA interactions in gradient-fractionatedspliceosomalcomplexes by psoralencrosslinking. Affinity-selectedcomplexes werefractionatedon a 1030% glycerolgradient, andcrosslinkingwasperformedwitheven-numberedgradient fractions (as indicatedaboveeachlane) or 2% ofunfractionatedeluate(E lanes). In theleft-mostE lane, theeluatewasUV-irradiatedin theabsence ofpsoralento control for nonspecificcrosslinking. RNA wastransferredto a nylon membrane thatwashybridizedsequentiallywith32P-labeled probes specificfor pre-mRNA(A) U2 snRNA(B) andU1 snRNA(C). Theidentityofthecrosslinkedspeciesisindicatedon theright. AMT, psoralen; PRE, pre-mRNA; intPRE, internallycrosslinkedpre-mRNA.

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