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Mesure du FRET par FLIMICIPNPlateforme d’Imagerie Cellulairede l’IFRde Neurosciences

Durée de vie de fluorescenceLa durée de vie de fluorescence est le temps moyen qu’une molécule reste à l’état excitéLe déclin de durée de vie de la E-GFP est mono-exponentiel, alors que celui de la CFP est un déclin bi-exponentielNICIPPlateforme d’Imagerie Cellulairede l’IFRde Neurosciences

NICIPPlateforme d’Imagerie Cellulairede l’IFRde NeurosciencesBref rappel sur la fluorescence dans le cas de FRETLa durée de vie de fluorescence est le temps moyen qu’une molécule reste à l’état excité’S1SoS1KKrrnDonneurTERFKTERFAccepteurLongueur d’onde (nm)

Pourquoi la mesure de durée de vie de fluorescencepermet de mesurer le FRET?rnKrDonneur FluorescenceAccepteurFluorescenceDonneur seul : τdonneur = 1/(Kr+Knr) Donneur + Accepteur FRETτ donneur = 1/(Kr+Knr+ KFRET) ΔtNICIPPlateforme d’Imagerie Cellulairede l’IFRde Neurosciences

NICIPMesure du FRET par FLIM: Plateforme d’Imagerie Cellulairede l’IFRde NeurosciencesProportion des molécules en interactionExemple: cas du donneur GFP avec durée de vie mono-exponentielleτ= temps moyen des durées de vieτ1τ2τΔtΔtΔtDéclinmono-exponentiel=100%desmoléculesdudonneursontlibrespasdeFRETDéclinmono-exponentielavecduréedeviediminuée=100%desmoléculesdudonneursonteninteractionFRETDéclinbi-exponentiel1/3desmoléculesdudonneureninteractionFRET2/3desmoléculesdudonneurlibrespasdeFRET

LresaMesure du FRET par FLIMFLIM= Fluorescence lifetime imaging microscopy0=tLaser pulseFluorochromepotSτ = moyenne des durées de vietratSMesure du ialédNICIPPlateforme d’Imagerie Cellulairede l’IFRde NeurosciencesComptage de photons unique corrélés en tempsDélaiΔt

lPauslesre Pulse 1Pulse 2Pulse 3Pulse 4...Pulse nMesure du FRET par FLIM76 Mhz un pulse toutes les 13 ns4 Mhz un pulse toutes les 250 nsPhoton émissionNICIPPlateforme d’Imagerie Cellulairede l’IFRde Neurosciencesτ = moyenne des durées de vieDélai (canaux)Δt(max 13 ns)A chaque pulse laser on récupère le Δt d’un seul photon permettant de construire l’histogramme du déclin de fluorescence

NICIPSystème d’acquisition pour le FLIMPlateforme d’Imagerie Cellulairede l’IFRde NeurosciencesphotodiodeTitane-Sapphire LaserScanner signal76 MHz (730-980 nm)with › 200 fs pulse (Coherent)Acquisition d’imageConfocal Scanner(Leica SP2)00010010111.0Détecteurs du FLIM (SPC)PMT ayant une haute résolution temporelleMesure du déclin de durée de vie de fluorescence

Exemple de mesure de FRET par FLIMPSD95-GFPStargazin-mCherryPDZ1PDZ2PDZ3PSD95-GFPStargazin-mCherrySuperpositionCoTnatnrdôleem p GosFiPti-fmCherryNICIPPlateforme d’Imagerie Cellulairede l’IFRde NeurosciencesEchantillonPSD95-GFPStargazin-GFP + Stargazin-mCherryPSD95–GFP + Stargazin –mCherryPSD95–CterGFP + Stargazin -mCherry

Exemple de mesure de FRET par FLIM00010010111P0S0D%9 5T-=G 2F.P066 nsPSD-95-GFPPSD-95-mCherry100% T= 2.083 nsτ= temps moyen des durées de vie de fluorescencePSStaDr-g9a5z-inG-FmPCherry6336..46%% TT12 == 12..009591 nnssNICIPPlateforme d’Imagerie Cellulairede l’IFRde NeurosciencesΔt (ns)Tandem GFP-mCherry30% T1 = 1.279 ns70% T2 = 2.096 ns

NICIPde l’IFRde NeurosciencesEfficacité de FRET et calcul de distance Plateforme d’Imagerie CellulaireE = efficacité de FRETE = 1-(τDA/τD)τDA= durée de vie du donneur en présence de l’accepteurτD= durée de vie du donneur en absence de l’accepteurR = distance entre le donneur et l’accepteur R = Ro x [(1/E)-1]1/6

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