Impact d'une contamination au méthylmercure par voie alimentaire sur l'expression génétique, la bioénergétique, et la reproduction chez le poisson zèbre Danio rerio

THESE
PRESENTEE A
L‟UNIVERSITE DE BORDEAUX 1

ECOLE DOCTORALE
« Sciences du Vivant, Géosciences et Sciences de l‟environne ment»

par Sébastien Cambier
POUR OBTENIR LE GRADE DE
DOCTEUR
SPECIALITE : Ecotoxicologie

Impact d‟une contamination au méthylmercure par voie alimentaire sur
l‟expression génétique, la bioénergétique, et la reproduction chez le poisson
zèbre Dan io rerio.

Thèse soutenue le 15 décembre 2009
Devant le jury composé de :
M. F. Leboulenger Professeur, Université du Havre Rapporteur
M. P. Bustamante Professeur, Université de la Rochelle Rapporteur
M. J. Cachot Professeur, Université Bordeaux 1 Examinateur
M. D. Brèthes CR CNRS, HDR Examinateur
M. P. Gonzalez CR CNRS, HDR Directeur de Thèse
M. J.P. Bourdineaud Professeur, Université Bordeaux 1 Directeur de Thèse



Remerciements

Je tiens à remercier le professeur Jean-Charles Massabuau pour m‟avoir accueilli au
sein de l‟équipe GEMA mais aussi pour ses astuces et les systèmes D très pratiques en
expérimentation.
Je remercie le professeur Jean-Paul Bourdineaud pour avoir accepté de m‟encadrer et
diriger tout au long de ces trois années de thèse. Je tiens également à le remercier pour sa
gentillesse et son humour tout aussi bien que pour ses connaissances scientifiques et ses
précieux conseils qui couvrent de larges domaines. Je le remercie également pour les
opportunités d‟enseignement en travaux pratiques et dirigés, volontaires et involontaires, qu‟il
m‟a donné .
Un grand merci à Patrice Gonzalez qui m‟a également encadré et dirigé tout au long de
cette thèse. Je te remercie pour tes conseils et tes réponses à mes multiples questions pas
forcément limitées à la biologie moléculaire ainsi que pour ta confiance. Outre ses qualités
scientifiques je tiens également à souligner ses grandes qualités humaines que sont sa
gentillesse et sa grande disponibilité, et bien sur sans oublier sa capacité surprenante à
toujours avoir un carré de chocolat sous la main.
Je suis particulièrement reconnaissant envers Daniel Brèthes de m‟avoir accueilli au
sein de l‟IBGC pour de longues journées et initié au monde de la biochimie et de la
bioénergétique.
Merci à Olivier Simon de bien avoir voulu se déplacer sur Arcachon et d‟avoir partagé
ses connaissances concernant la reproduction des poissons zèbres. Tu possèdes en effet des
compétences bien singulières dans ce domaine car ta simple présence a amené les poissons à
se reproduire.
Merci à Gilles Durrieu pour ses conseils avisés concernant les analyses statistiques que
j‟ai été amené à faire. Je tiens également à te remercier pour ton aide dans le mondee obscur
et énigmatique de la programmation.
Mes remerciements vont également à l‟ensemble de l‟équipe, et tout particulièrement
Nathalie, Pierre et Bruno pour leur humour et leur gentillesse.
Je fais un clin d‟œil tout particulier à Florence et à Cathy pour leur bonne humeur et
leur aide quotidienne pour passer outre les méandres administratifs qui sont si nombreux et
surgissent toujours où on les attend le moins.
Je tiens aussi fortement à remercier les doctorants qui partagent le même challenge que
moi : Mohamedou, Ika, Adeline, Simona, Sophie et Nicolas
Je tiens également à remercier sincèrement ma famille pour son soutien et son
réconfort. Je tiens également à remercier mes amis qui ont été pour moi une bouffée d‟air pur
tout au long de cette thèse.
Et enfin un énorme merci à toi mon ange pour ton soutien permanent et ta gentillesse
et cela malgré la distance et de bien avoir voulu me partager avec mes recherches se
prolongeant bien souvent pendant les weekends.



i

Sommaire

Introduction p 1
I/ Les différents sites pollués par le Hg p 2
II/ Le cycle biogéochimique du Hg p 6
A/ La spéciation chimique du mercure p 6
B/ Les transformations chimiques du mercure dans les milieux aquatiques p 6
1/ Les réactions d‟oxydoréduction p 6
2/ Les réactions de méthylation-déméthylation du mercure p 8
III/ Bioaccumulation et bioamplification du mercure dans les organismes aquatiques p 10
A/ La bioaccumulation du Hg par les organismes aquatiques p 10
B/ Biodisponibilité du Hg, interactions et transferts au travers des barrières
biologiques p 11
C/ Impacts cellulaires d‟une exposition au Me Hg p 14
D/ Mécanismes de protection des organismes contre le mercure p 16
IV/ Problématique p 17

Matériel et méthodes p 19
I/ Modèle biologique p 20
II/ Contamination de la nourriture p 20
III/ Contamination des poissons p 21
IV/ Dosage Hg p 21
V/ Génétique p 22
A/ Méthode appliquée au clonage d‟un gène d‟intérêt et à l‟étude de sa foncp 22 tion
B/ Analyse de la génotoxicité du MeHg p 26
C/ Analyse de la réponse génétique des tissus à une exposition au MeHg p 29
D/ Analyse du profil de l‟expression génétique d‟un tissu par utilisation de la
technique SAGE p 31
VI/ méthodes biochimiques appliquées à l‟analyse des impacts du MeHg sur les
mitochondries p 37
A/ Respiration sur fibres musculaires perméabilisées p 37
B/ Respiration sur cerveau p 39
C/ Isolement de la fraction mitochondriale p 39
I
D/ Le western-blot p 40
VII/ Analyses histologiques appliquées à l‟étude des fibres musculaires et du cerveau du
poisson zèbre p 40
A/ Préparation des échantillons pour la microscopie optique et électronique p 40
B/ L‟autométallographie p 41
VIII/ Etude de la reproduction des poissons p 41

Chapitre 1 : Analyse de la génotoxicité du MeHg dans le muscle
squelettique et le cerveau p 42
1-I/ Utilisation de la RAPD et de PCR quantitative en temps réel pour détecter les effets
génotoxiques du MeHg p 43
1-II/ Validation de l‟utilisation de la technique RAPD par l‟étude de la cgéiténotox d‟un ai utre
métal : le cadmium p 50

Chapitre 2 : Approche génétique de l’impact de la contamination au
méthylmercure p 83
2-I/ Analyse SAGE sur le muscle squelettique p 85
2-II/ Exploitation expérimentale à partir des données SAGE : le cas de Laptm4    p 111
2-III/ Analyse génétique de voies spécifiques du système nerveux central p 115

Chapitre 3 : Analyse des effets histologiques et bioénergétiques d’une
contamination par le méthylmercure p 122
3-I/Etude sur fibre musculaire p 123
3-II/Etude sur le cerveau p 133

Chapitre 4 : Impact du méthylmercure sur la reproduction du poisson
zèbre p 138
Conclusion et Perspectives p 146
Références bibliographiques p 152
Annexes p 173

II











Introduction















1























Principales mines de mercure Ceinture mercurifère

Figure 1 : Localisation des différentes zones mercurifères de la planète et des
principales mines de mercure (d‟après Beneš et Havlík, 1979, modi fié).








I/ Les différents sites pollués par le Hg.
Le mercure (Hg) est un métal présent naturellement dans les sols. Cependant ce métal
n‟est pas réparti de façon homogène dans l‟écorce terrestre, il se trouve naturellement
concentré au niveau de certaines zones géologiques dites actives formant ainsi les « ceintures
mercurifères » (Figure 1). Cette zone mercurifère se trouve principalement au niveau de
différentes failles autour du Pacifique, la faille himalayenne et le bassin méditerranéen ainsi
que le long de la dorsale atlantique. Le mercure se retrouve également, à des concentrations
supérieures au bruit de fond géologique, dans des zones extérieures à cette ceinture comme
par exemple les régions nord-tempérées et boréales (Suède, Finlande, Nord Québec…) ain