High pressure modulation of ToxR mediated signal transduction [Elektronische Ressource] / Kai Linke

TECHNISCHE UNIVERSITÄT MÜNCHEN
Lehrstuhl für Technische Mikrobiologie



High pressure modulation of ToxR mediated signal transduction


Kai Linke


Vollständiger Abdruck der von der Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan für
Ernährung, Landnutzung und Umwelt der Technischen Universität München zur Erlangung
des akademischen Grades eines
Doktors der Naturwissenschaften
genehmigten Dissertation.


Vorsitzender: Univ.-Prof. Dr. H.-Chr. Langowski
Prüfer der Dissertation: 1. Univ.-Prof. Dr. R. F. Vogel
2. Univ.-Prof. Dr. D. Langosch



Die Dissertation wurde am 27.11.2008 bei der Technischen Universität München eingereicht
und durch die Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan für Ernährung, Landnutzung
und Umwelt am 21.01.2009 angenommen.

Lehrstuhl für
Technische Mikrobiologie



High pressure modulation of ToxR mediated signal transduction

Kai Linke











Doctoral thesis
Fakultät Wissenschaftszentrum Weihenstephan für Ernährung, Landnutzung und Umwelt
Freising 2008

Vorwort

Mein Dank gilt:

Herrn Prof. Dr. Rudi F. Vogel für die Zurverfügungstellung des Themas, die zahlreichen
Anregungen und die vielen fachlichen Diskussionen.

Herrn Prof. Dr. Dieter Langosch für die Übernahme des Korreferats und für die
Zurverfügungstellung der Vibrio cholerae ToxR-Konstrukte.

Herrn Prof. Dr. Horst-Christian Langowski für die Übernahme des Prüfungsvorsitzes.

Herrn Prof. Dr. Matthias A. Ehrmann für die zahlreichen Ratschläge und Diskussionen.

Herrn Prof. Dr. Douglas Bartlett und Emiley Eloe für die gut Zusammenarbeit und
Gastfreundschaft.

Holger Teichert für seine Hilfsbereitschaft und die zahlreichen Diskussionen.

Nagarajan Periasamy für die gute Zusammenarbeit bei der Messung der GP-Werte.

Allen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern des Lehrstuhls für Technische Mikrobiologie für die
gute Arbeitsatmosphäre und die kollegiale Zusammenarbeit.

Meiner Familie und insbesondere meiner Mutter für Ihre anhaltende Unterstützung.

Und natürlich meiner Freundin Esther für Ihre unermüdliche Unterstützung und Motivation.








Abbreviations

AAS amino acid sequence
ACP acyl carrier protein
ATP adenosine-5’-triphosphate
bp base pair
cat chloramphenicol acetyltransferase (gene)
Da dalton
DNA desoxyribonucleic acid
dNTP desoxynucleotid phosphate
DSM DSMZ, Braunschweig, Germany
DSMZ Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen
E. Escherichia
EDTA ethylenediaminetetraacetic acid
Fig. Figure
g gram
G Gravity
GFP Green fluorescent protein
GP Generalized polarization
h hour
HHP High hydrostatic pressure
HP High pressure
HPLC high pressure liquid chromatography
L. Lactococcus
lacZ β-galactosidase (gene)
6M Mega (10 ), molar
-3m Milli (10 ), meter
min minutes
NCBI National center for Biotechnology Information
OD optical density
p pressure [Pa]
P. Photobacterium
PCR polymerase chain reaction
S. Saccharomyces

SDS sodium n-dodecylsulfate
s second
Tab. Table
TMS Trans membrane segment
TMW Technische Mikrobiologie Weihenstephan
TRIS tris (hydroxymethyl) aminomethan
v/v volume / volume
vol. volume
w/v mass / volume
ΔV reaction volume
-6μ Micro (10 )

Contents
1 Introduction ...................................................................................................................... 1
1.1 The general effects of high hydrostatic pressure (HHP) ............................................ 1
1.2 HHP in biological systems ......................................................................................... 2
1.3 Effects of HHP on microorganisms ........................................................................... 4
1.4 ToxR and ToxS .......................................................................................................... 8
1.5 ToxR-systems........................................................................................................... 10
1.6 Proteins under pressure ............................................................................................ 11
1.7 Biomembranes under pressure ................................................................................. 13
1.8 Objectives of the work ............................................................................................. 15
2 Material and Methods.................................................................................................... 16
2.1 Material .................................................................................................................... 16
2.1.1 Bacterial Strains ................................................................................................... 16
2.1.2 Plasmids ............................................................................................................... 17
2.1.3 Primer ................................................................................................................... 18
2.1.4 Chemicals and Enzymes....................................................................................... 18
2.1.4.1 Chemicals ..................................................................................................... 18
2.1.4.2 Enzymes ....................................................................................................... 19
2.1.4.3 Antibodies .................................................................................................... 19
2.1.4.4 Kits ............................................................................................................... 19
2.1.5 Equipment ............................................................................................................ 19
2.1.6 Software ............................................................................................................... 19
2.1.7 Media.................................................................................................................... 19
2.1.7.1 Growth media............................................................................................... 19
2.1.7.2 Media additives ............................................................................................ 20
2.1.8 Buffer ................................................................................................................... 20
2.1.8.1 DNA and enzyme buffer .............................................................................. 20
2.1.8.2 Buffer for agarose gel electrophoresis ......................................................... 21
2.1.8.3 Buffer for transformation ............................................................................. 21
2.1.8.4 Buffer for proteins........................................................................................ 21
2.2 Methods.................................................................................................................... 22
2.2.1 Isolation and display of DNA............................................................................... 22
2.2.1.1 Plasmid isolation from E. coli with QIAprep Spin Miniprep Kit ................ 22
2.2.1.2 Agarose gel electrophoresis ......................................................................... 23
2.2.1.3 Eckhard-lysis from E. coli............................................................................ 23
2.2.2 Polymerase chain reaction (PCR) ........................................................................ 24
2.2.2.1 General PCR................................................................................................. 24
2.2.2.2 Cleaning of PCR products with QIAquick PCR purification Kit ................ 25
2.2.2.3 MOE (mutagenesis by overlap extensions).................................................. 26
2.2.3 Cloning experiments ............................................................................................ 28
2.2.3.1 Cleavage of DNA by type II restriction enzymes ........................................ 28
2.2.3.2 Ligation ........................................................................................................ 28
2.2.3.3 Transformation of E. coli (CaCl ) ................................................................ 28 2
2.2.3.4 Transformation of E. coli according to Hanahan ......................................... 29
2.2.3.5 Conjugation of P. profundum....................................................................... 30
2.2.3.6 Chromosomal integration of DNA............................................................... 31
2.2.3.7 Vector construction ...................................................................................