Contrôle épigénétique du développement et de la qualité des fruits de tomate
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Thèse soutenue le 09 décembre 2008: Bordeaux 1
L’étude du contrôle de l’expression des gènes a été, au cours de ces dernières années, révolutionnée par la découverte des régulations épigénétiques. Parmi les différents acteurs participant à ces régulations se trouvent les protéines du groupe Polycomb (PcG). Ces protéines, initialement découvertes chez la drosophile, sont responsables de la mise en place et du maintien de marques épigénétiques au niveau de gènes cibles, qui sont alors réprimés. Les protéines PcG agissent sous forment de trois complexes dinstincts chez les animaux nommés PRC1 (Polycomb Repressive Complex 1), PRC2 (Polycomb Repressive Complex 2) et PhoRC (Pleiohomeotic Repressive Complex); le PRC2 possédant une activité histone méthyltransférase de type H3 K9/27. Chez les plantes, seules trois classes de protéines PcG sont retrouvées: la classe des Enhancer of zeste E(z), des Extra Sex Combs (ESC) et des Supressor of zeste 12 (Su(z)12), formant le complexe PRC2. Leur rôle dans le développement des plantes a été mis en évidence chez Arabidopsis, au niveau du gamétophyte femelle et de la graine, du maintien de l’état végétatif, de l’identité florale et de la vernalisation. Cependant leur implication dans le développement du fruit reste inconnue. Mon travail a permis d'identifier et de caractériser deux gènes PcG de la classe des E(z) de tomate exprimés dans le fruit, nommés SlEZ1 et SlEZ2. Les proteines SlEZ1 et SlEZ2 présentent l’ensemble des domaines caractéristiques des protéines de cette classe et sont localisées dans les noyaux. Les expériences de double hybride révèlent que les protéines SlEZ1 et SlEZ2 sont capables de former des complexes de type PRC2 avec certaines autres protéines PcG de tomate (de type ESC et Su(z)12). Ceci suggère que SlEZ1 et SlEZ2 sont effectivement des protéines fonctionnelles. L’analyse de des profils d’expression des gènes SlEZ1 et SlEZ2 révèle une expression ubiquitaire dans la plante au niveau de l’appareil végétatif, de la fleur et dans le fruit. Cependant, dans la fleur, seul SlEZ1 présente une expression dans les étamines tandis que les ARNm de SlEZ2 sont présent de façon spécifique dans le tissu de transmission du style. Dans le fruit, SlEZ1 est exprimé de façon constante, tandis que SlEZ2 semble faiblement exprimé dans les fruits en cours de mûrissement. Afin d’identifier la fonction de SlEZ1 dans le développement du fruit, des plantes transgéniques sous-exprimant SlEZ1 de façon constitutive ont été générées. Elles présentent une morphologie altérée de la fleur: les étamines sont torsadées et ne forment pas de cône staminal fermé. De plus, une augmentation du nombre moyen de carpelles par fruit est observée.
-Tomate
-Epigénétique
-Fruit
-Polycomb
-Développement
The control of gene expression has been challenged by the discovery of epigenetic regulation. Among the different factors involved in epigenetic regulations, the Polycomb (PcG) proteins are known to repress gene expression by setting epigenetic marks. The PcG protein, initially discovered in drosophila, act together in three distinct complexes named PRC1 (Polycomb Repressive Complex 1), PRC2 (Polycomb Repressive Complex 2) and PhoRC (Pleiohomeotic Repressive Complex). PRC2 complexes methylate histone H3 on lysines K9/27. In plants, only three classes of PcG protein has been found: the Enhancer of zeste (E(z)) class, the Extra Sex Combs (ESC) class and the Supressor of zeste 12 (Su(z)12) class, which belong to the PRC2. Their function in plant development has been brought to light in Arabidopsis thaliana. They control female gametophyte and seed development, maintain the vegetative development, and are involved in floral identity and vernalization. However, their function in fruit development is still unknown. My work was aimed to identify and characterize two PcG genes, named SlEZ1 and SlEZ2, encoding tomato E(z) class proteins. SlEZ1 and SlEZ2 proteins contain all the five E(z) characteristic domains and are both localized in the nucleus. Furthermore, as double-hybrid experiments reveal that both SlEZ1 and SlEZ2 proteins are able to form PRC2 complexes and interact with PcG proteins of other classes (ESC and Su(z)12 classes), it seems that these proteins are functional. Their expression profiles reveal ubiquitous expression during vegetative development (leaves, buds, stems) and reproductive development (flowers and fruits). However SlEZ1 is specifically expressed in the stamens whereas SlEZ2 shows specific expression in the transmitting tissue of the style. Moreover, their expression during fruit development shows some differences: if SlEZ1 expression is almost constant, SlEZ2 expression decreases during fruit development. In order to indentify SlEZ1 functions in fruit development, transgenic plants underexpressing constitutively SlEZ1 have been generated. These plants present altered flower morphology with twisted stamens and increased carpel number fruits.
-Tomato
-Epigenetic
-Fruit
-Polycomb
-Development
Source: http://www.theses.fr/2008BOR13741/document
N° d’ordre : 3741
THESE
PRESENTEE A
L’UNIVERSITE BORDEAUX 1
ECOLE DOCTORALE DES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA SANTE
PAR
Alexandre HOW KIT
POUR OBTENIR LE GRADE DE
DOCTEUR
SPECIALITE : BIOLOGIE VEGETALE
Contrôle épigénétique du développement et de la qualité
des fruits de tomate
soutenue le 9 décembre 2008
Après avis des rapporteurs :
M. Mondher BOUZAYEN Professeur à l’ENSAT
M. Stéphane MAURY Maître de conférence (HDR) Université d’Orléans
Devant la comission d’examen formée de :
M. Christian CHEVALIER Directeur de Recherche, INRA de Bordeaux Examinateur
M. Philippe GALLUSCI Maître de conférence (HDR), Université Bordeaux 1 Dir. de thèse
Mme. Valérie GAUDIN Chargée de recherche, INRA Versailles Examinatrice
M. Jean-Pierre RENAUDIN Professeur, Université Bordeaux 1 Président
ABREVIATIONS
3’UTR 3’UnTranslated Region (région non traduite en 3’)
5’UTR 5’UnTegion (région non traduite en 5’)
ADN Acide DésoxyriboNucléique
ADNc Aucléique complémentaire
ADN-T Acide Ducléique de Transfert
AIA cide Indole-3 Acétique
ARN Acide RiboNucléique
ARNi AiboNucléique interference
ARNm Acide RiboNucléique messager
ARNt AiboNucléique de transfert
BAP B enzylAminoPurine
BEt Bromure d’Ethydium
BSA ovine Serum Albumine
dA/C/G/TTP désoxyAdénos/Cytos/Guanos/Thymid/ine 5’TriPhosphate
DAPI 4',6' Di Amidino-2-Phényl Indole
DEPC D iEthyl PyroCarbonate
dNT d ésoxyNucléoside 5’TriPhosphate
D iThioThréitol
EDTA Acide Ethylène Diamine TétraAcétique
EMS E thyl MethaneSulfonate
EST xpressed Sequence Tag
IP I odure de Propidium
IPTG IsoPropyl-beta-D-ThioGalactopyranoside
LAXI LB Ampicilline X-Gal IPTG
LB Luria-Bertani
MS M urashige & Skoog
NBT/BCIP NitroBlue Tetrazolium/5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-Phosphate
disodique
ORF Open Reading Frame (cadre ouvert de lecture)
PBS Phosphate Saline Buffer
PCR Polymerase Chain Reaction
PMSF PhenylMethylSulphonyl Fluoride
PV olyVinylPyrrolidone
RACE Rapid Amplification of CDNA Ends mpnds
RNase iboNucléase
RT Reverse Transcription
SDS Sodium Dodecyl Sulphate
SDS PAGE S Dulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis
SSC Sodium chloride Sodium Citrate
SSPE Phosphate EDTA
TAE Tris Acétate EDTA
TC T entative Consensus
TIGR The Institute for Genome Research
UV Ultra-Violet
WT W ild Type (Type Sauvage)
X-Gal 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside
APS A mmonium PerSulfate TEMED N,N,N',N'-TEtraMEthyl-1-,2-Diaminomethane
UAS Upstream Activating Sequence
PEG P olyEthylene Glycol
BAC B acterial Artificial Chromosome
3AT 3-Amino-1,2,4-Triazole
Unités et facteurs de multiplication
°C degré Celcius
-6µ micro (10)
Da Dalton
DO D ensité Optique
g g ramme
h heure
ja j ours après l’anthèse
3k k ilo (10 )
L Litre
m mètre
-3m m illi (10 )
M M olaire (mole/litre)
min minute
-9n n ano (10 )
-12p p ico (10 )
p/v oids/volume
pb paires de bases
pH potentiel Hydrogène
sec seconde
U U nité enzymatique
v/v volume/volume
Gènes et protéines
AD A ctivating Domain
B B inding Domain
CLF C urly LeaF
E(Pc) E nhancer of Polycomb z nhancer of zeste
ESC xtra Sex Combs
GFP G reen Fluorescent Protein ST lutathione S-Transferase
HDAC Histone DéACétylase
HP1 Heterochromatin Protein 1
LHP1 L ike Heterochromatin Protein 1
MEA MEdeA
PcG du Groupe Polycomb (Polycomb Group)
PhoRC Pleiohomeotic Repressive Complex
PRC1 olycomb Repressive Complex 1
PRC2b Rive Complex 2
Su(var)3-9 Suppressor of variegation 3-9
Su(z)12 ppressor of zeste 12 SWN SWiNger
TrxG du Groupe Trithorax (Trithorax Group)
Stades de développement du fruit de tomate
B B reaker
MV M ature Vert
O O range
R R ed Ripe
SOMMAIRE
CHAPITRE 1 : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE ......................................................................................... 1
A) GENERALITES SUR LA CHROMATINE ....................................................................................................... 1
a. Qu’est ce que la chromatine ? ............................................................................................................... 1
b. Le nucléosome, unité de base de la chromatine .................................................................................... 2
c. Les régulations épigénétiques de la chromatine .................................................................................... 4
d. Euchromatine et hétérochromatine ....................................................................................................... 6
B) DIVERSITE ET CONSERVATION EVOLUTIVE ............................................................................................. 7
a. Découverte et classification ................................................................................................................... 7
b. Les classes de protéines PcG chez les végétaux .... 8
i. La classe des Enhancer of Zeste ....................................................................................................................... 10
ii. La classe des Extra Sex Combs ........................................................................................................................ 13
iii. La classe des Supressor of zeste 12 .................................................................................................................. 14
iv. La classe des Enhancer of Polycomb ............................................................................................................... 14
C) MODE D’ACTION DES PROTEINES PCG .................................................................................................. 15
a. Les protéines PcG agissent en complexes multi-protéiques ................................................................ 15
i. Le PRC1 ........................................................................................................................................................... 15
ii. Le PRC2 .................................... 17
1. Chez les animaux ........................................................................................................................................ 17
2. végétaux ........................................................................................................................................ 17
iii. Le PHoRC ........................................................................................................................................................ 18
b. Les Polycomb Response Element (PRE) .............................................................................................. 18
i. PHO ................................................................................................................................................................. 20
ii. Le Facteur GAGA (GAF) ................................................................................................................................ 20
iii. ZESTE ............................................................................................................................................................. 20
c. Remodelage de la chromatine ............................................................................................................. 21
i. Phase d’initiation ..................
