Adaptation aux métaux lourds d'une Fabacée (légumineuse) : réponses phénologique et moléculaire au plomb du Lathyrus sativus L.

UNIVERSITE PARIS EST
FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES



THESE
Pour obtenir le grade de : Docteur de l’Université Paris Est
Spécialité : Sciences de l’Univers et de l’Environnement

Présentée par :
Judicaëlle BRUNET

Adaptation aux métaux lourds d’une Fabacée (légumineuse) :

Réponses phénologique et moléculaire au plomb
du Lathyrus sativus L.







Soutenue le 19 décembre 2008
Direction de thèse : Mme Y. Zuily-Fodil, Professeur à l’Université Paris Est-Créteil
et Mme A. Repellin, Maître de conférences à l’Université Paris Est-Créteil

Equipe d’Ecophysiologie Moléculaire (LEPM), UMR-IRD 137 BIOSOL

Jury

M. P. Dizengremel, Professeur, Université Henri Poincaré Nancy 1 Président
Mme H. Sallanon, Professeur, Université d’Avignon et Pays de Vaucluse Rapporteur
M. G. Potters, Maître de conférences, Université de Antwerpen, Belgique Rapporteur
M. T. Sterckeman, HDR, INPL-INRA, Université Nancy Examinateur
Mme Y. Zuily-Fodil, Professeur, Université Paris Est-Créteil Examinatrice
Mme A. Repellin, Maître de conférences, Université Paris Est-Créteil Examinatrice REMERCIEMENTS REMERCIEMENTS


Avant de présenter les résultats de ce travail, je voudrais remercier tous
ceux qui, d’une manière ou d’une autre, ont contribué à sa réalisation :
Le Pr. Yasmine Zuily-Fodil et le Dr. Anne Repellin, mes directrices de thèse,
pour leur disponibilité, leur soutien et leur encadrement efficace tout au long
de ces trois années ;
Le Dr. Chantal Passaquet pour sa gentillesse, son écoute et le temps qu’elle a
accordé à mes nombreuses sollicitations scientifiques, techniques et autres,
Le Dr Gilles Varrault, du CEREVE, pour sa disponibilité et la formation qu’il
m’a apportée sur les analyses des métaux ;
Le Dr Patrick Ausset, du LISA, pour l’utilisation de son microscope
électronique à balayage ;
Le Dr. Daniel Laffray pour son aide précieuse en physiologie végétale et en
dépannage de toutes sortes ;
Les Drs Dominique Contour-Ansel et Maria Helena Cruz de Carvalho pour
leur soutien moral et scientifique ;
Les Drs Anh Pham Thi et Agnès d’Arcy Lameta pour leurs conseils avisés et
leur expérience ;
Fryni Grekis pour son aide administrative et ses conseils sur le Grèce ;
Ulrike, Biet et Georges mes collègues en thèse avec qui j’ai partagé de très
bons moments et dont les échanges scientifiques et personnels m’ont beaucoup
apporté et encouragé.

A tous ceux qui se reconnaitront, nous nous retrouvons rapidement pour
notre prochain « Tea time » (ou « quart d’heure culturel ») : Chantal avec le chocolat, Ulrike le thé et ses crayons mâchouillés, Biet sa lecture de
l’horoscope, Georges son humour…

Je tiens également à remercier les membres de mon jury pour le temps qu’ils
m’ont accordé malgré leur charge de travail.

Un merci tout particulier à toute ma famille qui m’a soutenue et encouragée
depuis toujours, dans mes études et dans la vie en général.
Merci à Romain de m’avoir supportée et encouragée ces dernières semaines
où ma thèse a du passer en priorité. ABREVIATIONS ABREVIATIONS

ABA acide abscissique
ABC ATP-binding cassette
AP aspartique protéase
APX ascorbate peroxydase
CAT catalase
CDF cation diffusion facilitator
CNGC cyclic nucleotide gated channel
CP cystéine protease
DHAR déhydroascorbate réductase
EDTA ethylene diamine tetraacetic acid
GR glutathion réductase
GSH glutathion
GSHS glutathion synthase
GST glutathion S-transférase
H-EDTA hydroxylethylene diamine tetraacetic acid
HSP heat shock protein
IPTG isoprpyl-beta-D-thiogalactoside
MDHAR monodéhydroascorbate réductase
MT métallothionéine
NRAMP natural resistance associated macrophage protein
Pb(NO ) nitrate de plomb 3 2
PC phytochélatine synthase
PLDα phospholipase D α
pUBQ polyubiquitine
ROS reactive oxygen species, espèces activées de l’oxygène
RWC relative water content, contenu relatif en eau
SOD superoxide dismutase
TI tolerance index, indice de tolérance
ZIP ZRT, IRT-like protein

LISTE DES ILLUSTRATIONS LISTE DES ILLUSTRATIONS

FIGURES

Figure 1 : Forme chimique du complexe Pb-EDTA.
Figure 2 : Structure d'une ATPase de type P.
Figure 3 : Structure putative des transporteurs de type CNGC chez les plantes.
Figure 4 : Structure des transporteurs protéiques ZIP.
Figure 5 : Organisation des domaines putatifs des transporteurs de type ABC, des sous
familles PDR et ATM.
Figure 6 : Structure des protéines NRAMP.
Figure 7 : Structure putative de la protéine MTP1 d’Arabidopsis thaliana.
Figure 8 : Structure type des protéines CAX.
Figure 9 : Schéma récapitulatif des transporteurs de métaux lourds dans une cellule végétale.
Figure 10 : Le cycle ascorbate-glutathion chez les plantes.
Figure 11 : Diagramme des différentes étapes de la réaction 5’ RACE.
Figure 12 : Diagramme des différentes étapes de la réaction 3’ RACE.
Figure 13 : Principe de la chambre à pression de Scholander.
Figure 14 : Potentiel hydrique moyen chez le Lathyrus sativus en fonction de la durée de la
sécheresse.
Figure 15 : Croissance de la racine principale et de la tige de Lathyrus sativus L. lignée
‘Bangladesh’ en fonction de la dilution du milieu de culture Hoagland et du temps.
Figure 16 : Croissance de la racine principale et de la tige de Lathyrus sativus L. lignée
‘Raipur’ en fonction de la dilution du milieu de culture Hoagland et du temps.
Figure 17 : Représentation schématique de la protéine produite par le gène CNGC. La région
indiquée entre les deux flèches correspond à la séquence protéique déduite de la séquence
d’ADNc isolée chez le Lathyrus sativus.
Figure 18 : Contenu en Pb dans les plantes de Lathyrus sativus, cultivées pendant 8 et 14 jours
dans du milieu Hoagland (1/10) sans phosphate additionné ou non de Pb et EDTA.
Figure 19 : Quantification des transcrits d’ARNm de LsCNGC, LsCP, LshGSHS et LsGR par
PCR en temps réel dans les racines et feuilles de plantes de Lathyrus sativus, cultivées, huit
jours, dans du milieu Hoagland (1/10) sans phosphate additionné ou non de Pb et EDTA.
Figure 20 : Assemblage des trois fragments isolés de la cystéine protéase de Lathyrus sativus.
Figure 21 : Séquence nucléotidique et séquence d’acides aminés déduite de l’ADNc complet
de Lathyrus sativus LsCP1 codant une cystéine protéase putative.
Figure 22 : Comparaison de la séquence en acides aminés de la cystéine protéase de Lathyrus
sativus LsCP1 avec les séquences homologues d’autres espèces.
Figure 23 : Schéma de la cystéine protéase LsCP1 isolée chez Lathyrus sativus.
Figure 24 : Schéma représentant la structure de la protéine codée par le gène de GCN. Les
flèches représentent le fragment isolé chez le Lathyrus sativus LsGCN.
Figure 25 : Quantification des transcrits d’ARNm de LsGCN par RT-PCR en temps réel dans
les racines et feuilles de plantes de Lathyrus sativus, cultivées, huit jours, dans du milieu
Hoagland (1/10) sans phosphate additionné ou non de Pb et EDTA.
Figure 26 : Schématisation des réponses des plantes de Lathyrus sativus à la présence de
nitrate de plomb dans le milieu de culture hydroponique.
TABLEAUX

Tableau 1 : Concentration de Pb dans le sol de différents sites contaminés ou non par des
métaux lourds.
Tableau 2 : Quantité de Pb accumulée dans les différents organes de plantes cultivées sur un
substrat solide.
Tableau 3 : Quantité de Pb accumulée dans les différents organes de plantes cultivées en
culture hydroponique.
Tableau 4 : Effet de l'ajout d'EDTA sur la disponibilité du Pb dans le sol et sur son absorption.
Tableau 5 : Conditions de culture des plantes de Lathyrus sativus en milieu hydroponique
suivant l'expérience menée.
Tableau 6 : Fréquence des mesures de longueur des racines et des tiges de Lathyrus sativus
dans les différentes cultures.
Tableau 7 : Culture hydroponique chez les Fabacées (légumineuses).
Tableau 8 : Morphologie des plantes de Lathyrus sativus lignée ‘Bangladesh’ en culture
hydroponique avec trois dilutions de milieu Hoagland différentes, à différents temps de
culture.
Tableau 9 : Descriptif de la morphologie des plantes de Lathyrus sa