THESE

THESE DE DOCTORAT DE L’UNIVERSITE PIERRE ET MARIE CURIE (PARIS 6) Spécialité Parasitologie Présentée par Mathieu GISSOT Pour obtenir le grade de DOCTEUR DE L’UNIVERSITE PARIS 6 Etude de la régulation transcriptionnelle des gènes lors du cycle érythrocytaire de Plasmodium falciparum. Implication des acteurs de la régulation transcriptionnelle dans les évènements clefs du cycle érythrocytaire. Soutenue le 07 février 2005 Devant le jury composé de Pr. Vincent MARECHAL Président du jury Pr. Christian VIVARES Rapporteur Dr. Jean-François DUBREMETZ Rapporteur Dr. Artur SCHERF Examinateur Dr. Isabelle ROSINSKI-CHUPIN Examinateur Dr. Catherine VAQUERO Directeur de thèse  Homme libre, toujours tu chériras la mer ! La mer est ton miroir ; tu contemples ton âme Dans le déroulement infini de sa lame, Et ton esprit n' est pas un gouffre moins amer. Baudelaire. Remerciements Je tiens tout d’abord à remercier chaleureusement Dominique Mazier pour l’accueil qu’elle m’a réservé au sein de son unité de recherche et pour son œil bienveillant sur mes travaux. Merci aux membres de mon jury d’avoir bien voulu se pencher quelques moments sur mon travail afin de l’enrichir de leurs critiques et commentaires. Je tiens plus particulièrement à remercier le Pr. Vivares et le Dr. Dubremetz d’avoir accepté avec enthousiasme d’être rapporteur de ma thèse. Merci à Catherine Vaquero de m’avoir donné la chance, que d’autres m’avaient refusée, de me lancer dans le grand bain de la Science. Merci de m’avoir guidé, accompagné et dirigé sur le chemin sinueux de ma thèse et pendant plus de 3 années. Si la connaissance est le savoir qui fait grandir, c’est cet inestimable trésor que m’a transmis Catherine. En me permettant librement de me confronter à la réalité de la paillasse, d’appréhender les difficultés de la réflexion scientifique et de m’impliquer dans la rédaction des articles, elle m’a offert la précieuse opportunité de grandir. Sans ces discussions passionnées, ses conseils avisés et cette liberté encadrée, mon travail n’aurait pu être identique. Pour tout ça et pour ton impressionnante capacité de travail, merci ! Merci à Sylvie Briquet de m’avoir offert son savoir et sa science sans contrepartie, d’avoir su m’aider à partager un peu plus. Merci pour sa chaleureuse présence, sa compétence et son professionnalisme. Merci à Philippe Refour d’avoir, avec abnégation et au prix de longs mois de sa thèse, construit, réalisé et produit la biopuce à ADN qui a été l’outil de base de mon travail. Merci pour son amitié et son inflexible goût pour les choses bizarres qui peuvent (éventuellement) se manger. Non, je ne ferais pas d’import de Root beer !! Merci à l’ensemble des personnels de l’unité 511 qui ont fait de mon séjour un moment forcément inoubliable. Plus particulièrement et dans le désordre merci à Charlotte, Carine, Anaïs, Julie, Virginie, Saddi, Maryse, Yvette, Nassira, Liliane, Monique, Olivier, Anthony, Jean-François, Maurel, Mr. Farahti, Mr. Sobolovic et Nicolas. Merci aux habitants de la plateforme P3S et notamment à Abiba et Laurent, pour leurs conseils et pour leur gentillesse. Merci aux stagiaires que j’ai torturées. Merci aux responsables du Magistère de génétique de l’Université Paris 7, de m’avoir offert, tout au long de ma thèse, d’ouvrir une fenêtre sur le monde de l’enseignement. Merci à mes parasites, morts dans d’affreuses souffrances. Pour finir, merci à mes parents et à mon frère d’avoir toujours cru en moi, de m’avoir donné cette envie et cette curiosité qui me poussent maintenant à aller au-delà de nos frontières. Merci pour votre présence rassurante et vos mots, prononcés ou pas, qui forment ce pont entre ce que je suis et mon devenir. Merci à mon frère d’avoir ouvert la voie de la Science et de me permettre de suivre sa piste. Merci aux yeux d’Emilie, à leur force et à leur lumière. SOMMAIRE Liste ds abréviatons 1 INTRODUCTION 3 1. LePaludisme 4 1.1 Aspects historiques 4 1.2 Aspects géographiques et démographiques 5 1.3 Aspects économiques 7 1.4 cliniques 9 2. Les cycles de vie de Plasmodium 11 2.1 Cycle parasitaire des plasmodies infectant l’homme 11 2.1.1 Le cycle exo-érythrocytaire 12 2.1.2 cyclérythrocytaire 12 2.1.3 Gamétocytogénèse 15 2.1.4 Cycle sexué chez le moustique 17 2.2 Cycle cellulaire 18 3. Le génome de Plasmodium falciparum 21 3.1 Composition et organisation du génome 21 3.2 La structure des chromosomes 22 3.3 Vue générale de la composition protéique 23 3.4 La composition en protéines assignées à la régulation génétique. 26 3.4.1 La machinerie générale de transcription 27 3.4.2 Régulateurs de la structure de la chromatine 28 3.4.2.a L’organisation de la chromatine 28 3.4.2.b Modification et remodelage de la chromatine 29 3.4.3 Facteurs de transcription spécifiques de séquence 31 3.4.3.a La superclasse des Domaines Basiques 32 3.4.3.b La superclasse des coordinateurs en doigt de Zinc 32 3.4.3.c La superclasse des Hélice-Tour-Hélice 34 3.4.3.d La superclasse des facteurs à architecture bêta 35 3.4.3.e Les FT non classées 37 3.4.4 Coactivateurs et corépresseurs transcriptionnels 37 3.4.4.a Le complexe «Mediator» 37 3.4.4.b Autres co-facteurs 38 3.4.5 Facteurs impliqués dans la régulation post transcriptionnelle 39 3.4.5.a Au niveau de l’ARNm 39 3.4.5.b Au niveau de la traduction 40 3.4.5.c Au niveau post-traductionnel 41 4. La régulation de l’expression des gènes chez P. falciparum 44 4.1 Etude à grande échelle de l’expression des gènes 44 4.1.1 Les études pré-génome 44 4.1.2 post-génome 45 4.2 La régulation transcriptionnelle 48 4.2.1 La structure des promoteurs 48 4.2.2 Les éléments de régulation 50 4.2.3 Les particularités 53 4.2.3.a Site d’initiation de la transcription 53 4.2.3.b Les régions homopolymériques 54 4.2.4 Les facteurs de transcription 55 4.3 Régulation post-transcriptionnelle 55 4.3.1 Régulation de l’épissage 55 4.3.2 Régulation de la stabilité des ARNm et de la traduction 56 4.3.3 ARN anti-sens 57 5. Présentation des travaux de thèse 60 MATERIEL &METHODES 62 1. Matériels 63 1.1 Clones de P. falciparum 63 1.2 Souches bactériennes et plasmides 63 1.3 Anticorps 63 2. Méthodes 4 2.1 Puce à ADN ciblée 64 2.1.1 Les gènes sélectionnés 64 2.1.2 Production des ADNc marqués et hybridation 65 2.1.3 Acquisition et analyse des données 65 2.2 RT-PCR quantitative en temps réel 65 2.3 Immuno-précipitation de la chromatine 68 RESULTAS 70 1. Recherche de facteurs impliqués dans la transition de la prolifération asexuée à la différenciation sexuée. 71 1.1. Résumé 71 Article 1. 72 Transcriptome of 3D7 and its gametocyte-less derivative F12 Plasmodium falciparum clones during erythrocytic development using a gene-specific microarray assigned to gene regulation, cell cycle and transcription factors. 2. Caractérisation fonctionnelle et rôle de PfMyb1, un facteur de transcription spécifique de séquence, dans la régulation des gènes au cours du cycle érythrocytaire. 84 2.1. Caractérisation fonctionnelle de PfMyb1 84 2.1 Résumé 84 Article 2. 6 Characterization of PfMyb1 transcription factor during erythrocytic development of 3D7 and F12 Plasmodium falciparum clones. 2.1.2 Résultats complémentaires 92 2.1.2.a Expression de la protéine PfMyb1 recombinante 92 2.1.2.b Etude de la cinétique d’expression du transcrit pfmyb1 93 2.1.2.c Etude tique d’expression de la protéine PfMyb1 95 2.2. Rôle de PfMyb1 lors du cycle érythrocytaire et caractérisation de son réseau de régulation. 97 2.1 Résumé 97 Article 3. 8 PfMyb1, a Plasmodium falciparum transcription factor, is required for intra-erythrocytic growth and controls key genes for cell cycle regulation. DISCUSSION 137 BIBLIOGRAPHIE 152 ANNEXES 167 1. Numéros d’accession des protéines liées à la régulation de l’expression des gènes chez P. falciparum. 168 1.1. Protéines annotées par nos soins. 168 1.2. Protéines annotées par Coulson et collaborateurs [58]. 171 2. Article 4 : Vers une utilisation des bio-puces à ADN pour l’étude d’isolats plasmodiaux de terrain. 172 3. Données et matériels supplémentaires de l’article 1. 180 4. Données et matériels supplémenta3. 192 Liste des abréviations Liste des abréviations : A: adénine ; aa: acide aminé ; ADN: acide désoxyribonucléique ; ADNc: ADN complémentaire à l’ARN ; ARN: acide ribonucléique ; ARNdb: ARN double brin ; ARNm: ARN messager ; ARNr: ARN ribosomaux ; ARNt: ARN de transfert ; ChIP: immuno-precipitation de la chromatine ; CO: Constans ; C : cycle threshold ; T DNase: désoxyribonucléase ; dNTP: désoxyribonucléotides tri-phosphate ; DPE: downstream promoter element ; DTT: dichlorodiphenyltrichloroethane ; FT: facteur de transcription ; HTH: Hélice-Tour-Hélice ; Inr: Initiator ; IRP: iron regulatory protein ; kb: kilobase ; Mb: mégabase ; MRE: myb regulatory element ; NAP: nucleosome assembly protein ; NLS: site de localisation nucléaire ; p.: page ; p.i: post-invasion ; pb: paire de bases ; PCR: réaction de polymérisation en chaîne ; PIB: produit intérieur brut ; qPCR: PCR quantitative en temps réel ; 1 Liste des abréviations RNase: ribonucléase ; RPMI: milieu “Roswell Park Memorial Institute” ; RRM: RNA Recognition Motif ; RT: transcription reverse ; T: thymine ; TAF: facteurs associés à la TBP ; TBP: TATA-binding-protein ; 2 Introduction INTRODUCTION 3