TRANSFERT GÉNIQUE PAR LENTIVECTEURS
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Français
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2005
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Niveau: Supérieur
MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Science de la Vie et de la Terre MEMOIRE Présenté par BOLLE Nicolas Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes TRANSFERT GÉNIQUE PAR LENTIVECTEURS Soutenu le : Jeudi 22 Décembre 2005 Devant le jury suivant : Jean-Marie EXBRAYAT -Président Xavier RONOT - Directeur d'études Benoît POLACK - Directeur de recherche Anne-Sophie GAUCHEZ - Examinateur Gilles PERNOD - Examinateur Laboratoire de Dynamique Cellulaire Directeur d'études : Pr. Xavier RONOT EPHE (Sciences de la Vie et de la Terre) () GREPI, MENRT EA 2938 Directeur de recherche : Pr. Benoît POLACK DBPC UF Hématologie () CHU de Grenoble ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la vie et de la Terre TRANSFERT GÉNIQUE PAR LENTIVECTEURS BOLLE NICOLAS Résumé : Le transfert génique recouvre différentes stratégies allant de l'injection d'ADN nu à l'administration de cellules transduites ex vivo et ré-injectées secondairement. EPHE Banque de Monographies SVT 1
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MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Science de la Vie et de la Terre MEMOIRE Présenté par BOLLE Nicolas Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes TRANSFERT GÉNIQUE PAR LENTIVECTEURS Soutenu le : Jeudi 22 Décembre 2005 Devant le jury suivant : Jean-Marie EXBRAYAT -Président Xavier RONOT - Directeur d'études Benoît POLACK - Directeur de recherche Anne-Sophie GAUCHEZ - Examinateur Gilles PERNOD - Examinateur Laboratoire de Dynamique Cellulaire Directeur d'études : Pr. Xavier RONOT EPHE (Sciences de la Vie et de la Terre) () GREPI, MENRT EA 2938 Directeur de recherche : Pr. Benoît POLACK DBPC UF Hématologie () CHU de Grenoble ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la vie et de la Terre TRANSFERT GÉNIQUE PAR LENTIVECTEURS BOLLE NICOLAS Résumé : Le transfert génique recouvre différentes stratégies allant de l'injection d'ADN nu à l'administration de cellules transduites ex vivo et ré-injectées secondairement. EPHE Banque de Monographies SVT 1
- plasmide d'empaquetage
- acide ethylène
- nadph oxydase
- transfert génique par lentivecteurs
- cellule souche
- promoteur woodchuck
- oxydase phagocytaire
MEMOIRE
Présenté par
MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L’EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Science de la Vie et de la Terre BOLLE Nicolas Pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes TRANSFERT GÉNIQUE PAR LENTIVECTEURS Soutenu le :Jeudi 22 Décembre 2005 le jury suivant : Devant Jean-Marie EXBRAYAT-Président Xavier RONOT- Directeur d’études Benoît POLACK - Directeur de recherche Anne-Sophie GAUCHEZ-urteimanEax Gilles PERNOD-maxEruetani Laboratoire de Dynamique CellulaireDirecteur d’études :Pr. Xavier RONOT EPHE ((Sciences de la Vie et de la Terre)onorju@tvax.rei.flergrf-oben) GREPI, MENRT EA 2938 Directeur de recherche :Pr. Benoît POLACK DBPC UF Hématologie (BPolack@chu-grenoble.fr) CHU de Grenoble ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la vie et de la Terre TRANSFERT GÉNIQUE PAR LENTIVECTEURS BOLLE NICOLAS Résumé : Le transfert génique recouvre différentes stratégies allant de l’injection d’ADN nu à l’administration de cellules transduitesex vivoet ré-injectées secondairement.
Ce type de stratégie repose, entre autre, sur l’utilisation de vecteurs viraux basés sur les propriétés des lentivirus : les lentivecteurs. Ils permettent la transduction de cellules quiescentes comme le sont les cellules souches, ils donnent des expressions stables puisqu’ils permettent une insertion du transgène directement dans l’ADN de la cellule cible, ils sont également dépourvus de séquence codante virale et par conséquent non immunogènes. Dans ce travail, nous montrons que le transfert génique par lentivecteurs peut-être utilisé dans différents domaines. Dans un premier temps, nous avons reconstitué le cytochrome b558du complexe de la NADPH oxydase dans une lignée cellulaire dépourvu de ce complexe. Dans un deuxième temps, nous avons transduit des lignées cellulaires hématopoïétiques en vue d’intégrer le gène du Facteur IX de la coagulation. A la suite de cette étude nous pouvons remarquer que le gène est correctement inséré et exprimé au sein de ces lignées, et plus particulièrement la lignée mégacaryocytaire DAMI. Dans un troisième temps, en relation étroite avec le Facteur IX, nous avons étudié le transfert génique avec le gène de la GFP dans les cellules souches hématopoïétiques en vue de les différencier en Mégacaryocytes. Mots clés : transfertFacteur IX de la coagulation, cellules souches génique, lentivecteurs, NADPH oxydase, hématopoïétiques CD34+.
SOMMAIRE :
SOMMAIRE : .......................................................................................................................................................................................... 1 ABREVIATIONS : ............................................................................................................................................................................... 4 INTRODUCTION : ............................................................................................................................................................................. 6 I. Le transfert génique:........................................................................................................................................................ 9 1. Les méthodes physiques :......................................................................................................................................... 9 a. L’électroporation : .................................................................................................................................................. 9 b. Le bombardement particulaire :................................................................................................................. 9 c. La micro-injection :............................................................................................................................................... 9 2. Les méthodes chimiques :..................................................................................................................................... 10 a. Le phosphate de calcium :............................................................................................................................ 10 b. Les liposomes :....................................................................................................................................................... 11
c. Les polymères synthétiques :...................................................................................................................... 11 3. Les méthodes biologiques :.................................................................................................................................. 11 a. Les baculovirus :................................................................................................................................................... 11 b. Les adénovirus :.................................................................................................................................................... 12 c. Les virus associés aux adénovirus :...................................................................................................... 12 d. Les rétrovirus :....................................................................................................................................................... 13 II. Le transfert génique par lentivecteurs :........................................................................................................ 15 1. Le Virus de l’Immunodéficience Humaine (VIH) :....................................................................... 16 2. Généralités : ..................................................................................................................................................................... 16 3. Les lentivecteurs :........................................................................................................................................................ 18 a. Les plasmides :....................................................................................................................................................... 18
Ø Le plasmide d’empaquetage :............................................................................................................. 18 Ø Le plasmide d’enveloppe :..................................................................................................................... 18 Ø Le plasmide de transfert :...................................................................................................................... 19 b. La production des virions :.......................................................................................................................... 19 III. Le transfert génique du complexe NADPH oxydase phagocytaire :..................................... 20 1. Le complexe NADPH oxydase phagocytaire:...................................................................................... 20 a. Son rôle : ..................................................................................................................................................................... 20 b. Son activation :...................................................................................................................................................... 22 c. Son assemblage :..................................................................................................................................................
