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N? d?ordre : 2350

THESE


prØsentØe pour l?obtention du titre de

DOCTEUR DE L?INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE TOULOUSE

Ecole doctorale : S.E.V.A.B.
FiliŁre : QualitØ et SØcuritØ des Aliments

TITRE
CARACTERISATION FONCTIONNELLE D’UN FACTEUR D’ELONGATION
MITOCHONDRIAL LeEF-Ts CHEZ LA TOMATE. mt
APPROCHES PAR TRANSGENESE ET PROTEOMIQUE

par

CØsar Luis GIRARDI


Soutenue le 26 Juin 2006
devant le jury composØ de :


M. Mondheur BOUZAYEN PrØsident
M. Guy ALBAGNAC Rapporteur
M. Pravendra NATH Rapporteur
M. Jean-Claude PECH Directeur de thŁse
M. Alain LATCHE Membre
M. Michel ROSSIGNOL Membre
M Anne BERNADAC Membre invitØ

Laboratoire GØnomique et Biotechnologie des Fruits, UMR INRA/INP-ENSAT N? 990
- 2 -
REMERCIEMENTS
Merci au Laboratoire GØnomique et Biotechnologie des Fruits en nome de son directeur
Mondheur BOUZAYEN pour m?avoir accueilli pendant ces 4 ans de travail.

Je tiens ? remercier et exprimer ma profonde reconnaissance ? Jean-Claude PECH pour
diriger cette thŁse et pour m?avoir fait confiance tout au long de mes Øtudes.

Je voudrais Øgalement remercier Anne BERNADAC et Alain LATCHE pour m’avoir
encadrØ et pour le temps, la disponibilitØ, l?Ønergie avec qui l?apprentissage Øtait
agrØable.

Toute ma gratitude ? Michel ROSSIGNOL pour l?intØrŒt qu?il a portØ ? mon travail et
pour m?avoir soutenu dans Øtudes de spectromØtrie de masse, sans oublie GisŁle
BORDERIES et Carole PICHEREAUX pour ses conseils techniques et scientifiques et
Mohamed ZOUINE pour la parti bioinformatique.

Je remercie Pierre MAURY pour ses conseils et sa disponibilitØ.

Je tiens aussi ? remercier Kalina BERMUDES pour son aide avec qui j?ai passØ
d?agrØables moments dans la paillasse du laboratoire.

Ce travail Øtant le fruit de nombreuses collaborations et contributions et pour ?a
j?exprime mes remerciements ? toutes les personnes et l’ensemble des membres du
laboratoire.

Je remercie les diffØrents membres du jury et Guy ALBAGNAC et Pravendra NATH
pour avoir acceptØ de juger ce travail en tant que rapporteurs.

Je voudrais remercier la CAPES pour m?avoir accordØ une bourse d?Øtude et la Embrapa
Uva e Vinho pour m?avoir dispensØ de mes activitØs professionnel de recherche en
permettant de rØalisØ avec tranquillitØ mon doctorat.

Cette thŁse est dØdiØe ? ma femme et tous les membres de ma famille qui Øtait
toujours ? mon c?tØ et pour leur soutien qui a contribuØ ? la rØussite de ce travail, et
m?ont permis de garder le moral dans les moments difficiles.


- 3 -
SOMMAIRE
RESUME EN FRANCAIS ................................................................................................................................... 3
RESUME EN ANGLAIS...................................................................................................................................... 4
RESUME EN PORTUGAIS ................................................................................................................................ 5
BREVE PRESENTATION GENERALE ET OBJECTIFS.............................................................................. 8
INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE ....................................................................................................... 11
1-BIOSYNTHESE ET ROLE DE L?ETHYLENE......................................................................................................... 12
1-1- Facteurs externes influant sur la synthŁse d?ØthylŁne et sur maturation............................................. 14
1-2 Les mØcanismes dØpendants de l?ØthylŁne au cours de la maturation des fruits................................... 14
2- MECANISMES DE LA CRISE RESPIRATOIRE..................................................................................................... 15
3- FONCTIONNEMENT ET ROLE DES MITOCHONDRIES ........................................................................................ 16
4 - LE GENOME MITOCHONDRIAL ET SON EXPRESSION....................................................................................... 18
5- L?IMPORTATION DES PROTEINES DANS LES MITOCHONDRIES ........................................................................ 20
6- ROLE DE LEEF-TS ET MECANISMES DE SYNTHESE DES PROTEINES CHEZ LES MITOCHONDRIES.................. 21 MT
7- LES STRESS OXYDATIFS ET LE ROLE DE LA MITOCHONDRIE........................................................................... 22
8- PROTEOMIQUE DE LA MITOCHONDRIE........................................................................................................... 24
CHAPITRE I....................................................................................................................................................... 27
THE MITOCHONDRIAL ELONGATION FACTOR LEEF-TS IS REGULATED DURING TOMATO MT
FRUIT RIPENING AND UPON WOUNDING AND ETHYLENE TREATMENT .................................... 27
ABSTRACT ........................................................................................................................................................ 27
1. INTRODUCTION........................................................................................................................................ 28
2. MATERIALS AND METHODS ........................................................................................................................... 29
2.1. Plant material....................................................................................................................................... 29
2.2. Ethylene and MCP treatment, wounding and temperature shocks...................................................... 29
2.3. Phylogenic tree..................................................................................................................................... 29
2.4. RNA isolation, RT-PCR and real-time PCR ......................................................................................... 29
2.5. CO and ethylene production measurements........................................................................................ 30 2
2.6. Generation of sense and antisense LeEF-Ts plants ........................................................................... 30 mt
3. RESULTS........................................................................................................................................................ 31
3.1. Tomato LeEF-Ts is encoded by a single copy gene ........................................................................... 31 mt
3.2 LeEF-Ts gene is expressed at higher levels in fruit and is regulated during fruit ripening................ 31 mt
3.3. LeEF-Ts gene expression is stimulated in fruit by ethylene, wounding and temperature shocks....... 34 mt
3.4. Physiological characterisation of sense and antisense LeEF-Ts plants ............................................ 36 mt
4. DISCUSSION AND CONCLUSION...................................................................................................................... 39
REFERENCES ..................................................................................................................................................... 41
CHAPITRE II ..................................................................................................................................................... 44
EFFETS DE LA SUR OU SOUS-EXPRESSION DU GENE LEEF-TS SUR LA REPONSE AUX MT
STRESS OXYDATIFS DES PLANTES DE TOMATE .................................................................................. 44
1. INTRODUCTION........................................................................................................................................ 44
2- MAT?RIEL ET M?THODES ..................................................................................................................... 46
2.1 - MatØriel vØgØtal .................................................................................................................................. 46
2.2 - Application des stress.......................................................................................................................... 46
2.2.1- Traitement avec Paraquat ............................................................................................................................... 46
2.2.2 - Traitement SØcheresse................................................................................................................................... 47
2.2.3 - Traitement ? la Chaleur ................................................................................................................................. 47
2.3 ? Dosage des activitØs enzymatiques..................................................................................................... 47
2.3.1 - Extraction et dosag