Module Intégré Dermatologie Bases et principes du diagnostic biologique des mycoses cutanéo phanériennes et muqueuses
10
pages
Français
Documents
2005
Le téléchargement nécessite un accès à la bibliothèque YouScribe Tout savoir sur nos offres
10
pages
Français
Documents
2005
Le téléchargement nécessite un accès à la bibliothèque YouScribe Tout savoir sur nos offres
Niveau: Supérieur
Module Intégré 5 Dermatologie Bases et principes du diagnostic biologique des mycoses cutanéo-phanériennes et muqueuses Faculté de Médecine Montpellier-Nîmes Octobre 2005 Dr P. Rispail BASES ET PRINCIPES DU DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE DES MYCOSES MUQUEUSES ET CUTANÉO-PHANÉRIENNES Objectifs pédagogiques - Connaître les modalités des différentes techniques mises en œuvre dans le cadre du diagnostic biologique des mycoses muqueuses et cutanéo-phanériennes. Savoir prescrire un examen mycologique et savoir en interpréter les résultats. - Connaître l'intérêt de la recherche d'une fluorescence sous rayonnement ultra-violet dans le diagnostic de certaines mycoses cutanéo-phanériennes. - Dans le cadre du diagnostic biologique des mycoses muqueuses et cutanéo-phanériennes, reconnaître la prééminence de la mise en évidence, par l'examen direct, du Champignon à l'état « parasitaire ». - Dans le cadre du diagnostic biologique des mycoses muqueuses et cutanéo-phanériennes, connaître les modalités d'isolement et d'identification des Champignons par culture mycologique. Plan de cours I - INTRODUCTION..................................................................................................................2 II - RECHERCHE D'UNE FLUORESCENCE SOUS RAYONNEMENT ULTRA-VIOLET (« LAMPE DE WOOD »)..........................................................................................................3 III – PRÉLÉVEMENTS .............................................................................................................4 IV - EXAMEN DIRECT .............................................................................................................5 IV.1 - Examen direct « à frais »........................................................................................................ 6 IV.2 - Examen direct après coloration ............................................................................................ 6 V - CULTURES ........................................................................................................................7 V.
Voir
Module Intégré 5 Dermatologie Bases et principes du diagnostic biologique des mycoses cutanéo-phanériennes et muqueuses Faculté de Médecine Montpellier-Nîmes Octobre 2005 Dr P. Rispail BASES ET PRINCIPES DU DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE DES MYCOSES MUQUEUSES ET CUTANÉO-PHANÉRIENNES Objectifs pédagogiques - Connaître les modalités des différentes techniques mises en œuvre dans le cadre du diagnostic biologique des mycoses muqueuses et cutanéo-phanériennes. Savoir prescrire un examen mycologique et savoir en interpréter les résultats. - Connaître l'intérêt de la recherche d'une fluorescence sous rayonnement ultra-violet dans le diagnostic de certaines mycoses cutanéo-phanériennes. - Dans le cadre du diagnostic biologique des mycoses muqueuses et cutanéo-phanériennes, reconnaître la prééminence de la mise en évidence, par l'examen direct, du Champignon à l'état « parasitaire ». - Dans le cadre du diagnostic biologique des mycoses muqueuses et cutanéo-phanériennes, connaître les modalités d'isolement et d'identification des Champignons par culture mycologique. Plan de cours I - INTRODUCTION..................................................................................................................2 II - RECHERCHE D'UNE FLUORESCENCE SOUS RAYONNEMENT ULTRA-VIOLET (« LAMPE DE WOOD »)..........................................................................................................3 III – PRÉLÉVEMENTS .............................................................................................................4 IV - EXAMEN DIRECT .............................................................................................................5 IV.1 - Examen direct « à frais »........................................................................................................ 6 IV.2 - Examen direct après coloration ............................................................................................ 6 V - CULTURES ........................................................................................................................7 V.
- fragments d'ongles …
- fluorescence en plaques variant du jaune verdâtre au jaune orangé
- lésion
- examen direct du matériel
- identification des champignons filamenteux
- fluorescence
- examen direct
- principes du diagnostic biologique des mycoses cutanéo-phanériennes
- squames
Module Intgr 5 Dermatologie
Bases et principes du diagnostic biologique des mycoses cutano-phanriennes et muqueuses
BASES ET PRINCIPES DU DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE DES MYCOSES MUQUEUSES ET CUTANO-PHANRIENNESObjectifs pdagogiques - Connatre les modalits des diffrentes techniques mises en œuvre dans le cadre du diagnostic biologique des mycoses muqueuses et cutano-phanriennes. Savoir prescrire un examen mycologique et savoir en interprter les rsultats. - Connatre lintrt de la recherche dune fluorescence sous rayonnement ultra-violet dans le diagnostic de certaines mycoses cutano-phanriennes. - Dans le cadre du diagnostic biologique des mycoses muqueuses et cutano-phanriennes, reconnatre la prminence de la mise en vidence, par lexamen direct, du Champignon ltat « parasitaire ». - Dans le cadre du diagnostic biologique des mycoses muqueuses et cutano-phanriennes, connatre les modalits disolement et didentification des Champignons par culture mycologique. Plan de cours I - INTRODUCTION..................................................................................................................2II - RECHERCHE DUNE FLUORESCENCE SOUS RAYONNEMENT ULTRA-VIOLET (« LAMPE DE WOOD ») ..........................................................................................................3III – PRLVEMENTS .............................................................................................................4IV - EXAMEN DIRECT .............................................................................................................5IV.1 - Examen direct « frais »........................................................................................................ 6IV.2 - Examen direct aprs coloration ............................................................................................ 6V - CULTURES ........................................................................................................................7V.1 - Isolement .................................................................................................................................. 7V.2 - Identification ............................................................................................................................ 8V.2.1 - Identification des Levures.................................................................................................. 8V.2.2 - Identification des Champignons filamenteux..................................................................... 9
Facult de Mdecine Montpellier-Nmes
Module Intgr 5 Dermatologie
Bases et principes du diagnostic biologique des mycoses cutano-phanriennes et muqueuses
I - INTRODUCTION Pour le clinicien, les buts du diagnostic biologique des mycoses muqueuses et cutano-phanriennes sont : - confirmer la mycose, ou, au contraire, sur la base dune rponse ngative, rorienter le diagnostic ; - identifier l'(ou les) agent(s) fongique(s) incrimin(s) et adapter au mieux la thrapeutique ; - comprendre la pathognie de la mycose et amoindrir (voire supprimer) les facteurs favorisant son dveloppement. Dans ce cadre, la dmarche mise en oeuvre par le laboratoire est influence par : - la symptomatologie clinique ; - les facteurs pidmiologiques inhrents au patient ; - le « terrain » immunitaire sous-jacent. Hormis : - quelques rares cryptococcoses cutanes primaires (par inoculation) ou secondaires (par dissmination hmatogne chez le siden) ; - quelques mycoses dermo-pidermiques galement par dissmination hmatogne de Champignons impliqus dans des mycoses tissulaires chez limmunodprim ou par contamination arienne de plaies, brlures, … par desCandida, des Aspergillus; - et dexceptionnelles sporotrichoses, des Mucorales ou par diverses Dmatiaces autochtones, la pathologie muqueuse et cutano-phanrienne dorigine fongique dveloppe en Europe se rsume essentiellement : - aux pityrosporoses ( = malassezioses) : pityriasis versicolor, pityriasis capitis, folliculite Pityrosporum; - aux candidoses buccales (chilite et perlche, stomatites aigus ou chroniques) et digestives (de lœsophagite lanite), gnitales (vulvo-vaginite, balano-posthite, …), cutanes (intertrigos des grands plis et des sillons interdigitaux, parfois interdigito-plantaires, …) et unguales (onyxis avec pri-onyxis) ; - et aux dermatophytoses : onychomycoses dermatophytiques, en particulier des orteils, occasionnellement compliques dune colonisation secondaire par un Champignon filamenteux opportuniste (Scopulariopsis brevicaulis,Fusariumdermatophytoses de la peau dite…) ; sp., « glabre » (dermatophytose cutane circine, dermatophytose inguino-crurale, dermatophytose interdigitoplantaire, …) ; teignes du cuir chevelu (teignes tondantes microsporiques ou trichophytiques, teigne favique) ; folliculites suppures (sycosis ou mentagre, krion). Dune manire gnrale, le diagnostic biologique d'une mycose muqueuse ou cutano-phanrienne repose sur : - la rvlation d'une ventuelle fluorescence sous rayonnement ultra-violet de certaines lsions fongiques de la peau ou du cuir chevelu ; - la mise en vidence du (ou des) Champignon(s) l'tat parasitaire par examen direct du produit biologique prlev ; - lisolement et lidentification de ce(s) Champignon(s) par cultures. L'valuation de la sensibilitin vitro du Champignon divers antifongiques (« antifongigramme ») est exceptionnellement justifie et na que trs peu dintrt en pratique courante. Ni la recherche danticorps spcifiques, ni celle d'antignes fongiques circulants ne sont justifies dans le cadre du diagnostic des mycoses muqueuses et cutano-phanriennes. La biologie molculaire (dtection de Champignons dans le matriel biologique, identification spcifique …) reste encore actuellement du domaine de la recherche.
Facult de Mdecine Montpellier-Nmes
Module Intgr 5 Dermatologie
Bases et principes du diagnostic biologique des mycoses cutano-phanriennes et muqueuses
Lordonnance prescrivant lexamen mycologique d'une mycose muqueuse ou cutano-phanrienne sera donc rdige ainsi : « Examen mycologique dune lsion de … : prlvement, examen direct et cultures (isolement et identification) ». Lventuelle recherche dune fluorescence sous lampe de Wood pourra tre mentionne si elle na pas t effectue par le clinicien. II - RECHERCHE DUNE FLUORESCENCE SOUS RAYONNEMENT ULTRA-VIOLET (« LAMPE DE WOOD ») Les voies biochimiques utilises par certaines espces particulires de Champignons pour dgrader les molcules organiques constitutives de la peau et des phanres (notamment la kratine) aboutissent la prsence, dans les tissus coloniss, de substances spontanment fluorescentes sous un rayonnement ultra-violet d'une frquence donne. L'examen de ces lsions cutano-phanriennes ainsi « claires » l'aide de la lampe de Wood peut rvler cette fluorescence, et donc fortement tayer le diagnostic positif de mycose. La teinte de la fluorescence oriente vers un type de Champignon (ventuellement vers un diagnostic diffrentiel non mycologique). L'tendue des zones cutanes fluorescentes permet un bilan d'extension de lactivit du Champignon et guide le geste de prlvement en vue de l'examen mycologiqueproprementdit.Toutefois,l'absencedefluorescencenetteni'nfirmeenrienlediagnosticde mycose. En pratique courante, cet examen para-clinique fait partie du diagnostic des pityrosporoses (= malassezioses) et de certaines dermatophytoses : * L'examen sous lampe de Wood des lsions hyper-chromiques (plus rarement des lsions hypo- ou achromiques) du pityriasis versicolor met en vidence une fluorescence en plaques variant du jaune verdtre au jaune orang. Il rvle les atteintes invisibles l'œil nu et permet un bilan d'extension l'ensemble du tronc, des hanches, des cuisses, ... ☞Pour en savoir plus Par contre, la fluorescence « gris perle » de lsions hypochromiques oriente plutt vers un vitili o.Cette mme fluorescence jauntre : -en plaques sur le cuir chevelu est fortement en faveur d'un pityriasis capitis ; - ponctuelle au niveau des follicules pilo-sbacs oriente vers une pityrosporose folliculaire. * Une fluorescence verte sous rayonnement ultra-violet des petits cheveux casss courts est un argument majeur du diagnostic de certaines teignes tondantes microsporiques, notamment des teignes Microsporum canis(galement M. audouini langeroni) et, plus accessoirement en Europe, du favus Trichophyton schoenleini. Ce sont, bien entendu, ces petits cheveux fluorescents qui seront prlevs en priorit en vue de l'examen mycologique. ☞Pour en savoir plus D'autre part, au cours de toute lsion microsporique de la peau (dermatophytose circine Microsporum), le duvet peut tre colonis par le Champignon, de la mme manire que le cheveu au cours des teignes, notamment en priphrie des lsions. De plus, c'est au niveau des poils follets et duvets que les Dermatophytes, en particulier lesMicrosporum, subsistent aprs un traitement insuffisant.Leurfluorescencedoitdonctresystmatiquementrecherche(bienqui'nconstantesilepoil, trop fin, est peu parasit). A noter : la fluorescence rouge sous rayonnement ultra-violet d'une lsion cutane inguino-crurale oriente le diagnostic vers un rythrasma, lsion due une Bactrie du genreCorynebacterium.
Facult de Mdecine Montpellier-Nmes
Module Intgr 5 Dermatologie
Bases et principes du diagnostic biologique des mycoses cutano-phanriennes et muqueuses
III - PRLVEMENTS De l'efficacit du geste de prlvement et de la quantit du matriel biologique prlev dpend le succs des tapes ultrieures du diagnostic mycologique. Les prlvements doivent tre effectus avant tout traitement antifongique par voie gnrale ou en application locale. Les prcautions d'usage de strilit visent, entre autres, viter la contamination du matriel biologique par les Bactries, mais galement par des Levures ou des Champignons filamenteux prsents dans le milieu extrieur ou l'tat saprobiontique chez le patient : conditions optimales d'asepsie, strilit du matriel de prlvement et de recueil … Le matriel strile utilis pour le prlvement est fonction du type et de la localisation de la lsion et du produit biologique recueillir : couvillon humidifi au moyen dun peu de liquide physiologique strile, curette de Brocq fentre, scalpel mousse (c'est dire non aiguis) ou vaccinostyle, pinces piler, ciseaux fins, pinces et ciseaux ongles, bistouri d'Harouet (ou Punch- biopsy ), … Les produits biologiques prlevs sont : * les mucosits (couvillonnage de muqueuses) * le suintement des intertrigos, le pus des pri-onyxis (couvillonnage) * les squames (scalpel mousse, curette de Brocq) * les cheveux, poils et duvets (pinces piler) * les fragments d'ongles et la matire sous-unguale (scalpel mousse, curette de Brocq) * les fragments tissulaires (biopsies, pices opratoires) ☞Pour en savoir plus Casparticulierdesprlvementscutano-phanriens:ilconvientdi'nsistersurlefaitque,pour ce type de prlvements, l'utilisation de l'couvillon (ventuellement humidifi au moyen de liquide physiologique) est un pis-aller. Il ne doit, en aucun cas, tre utilis seul pour les lsions du cuir chevelu, les folliculites suppures, les atteintes unguales, les lsions cutanes sches. Cette mauvaise pratique est la cause de la plupart des fausses ngativits. Ces dernires entranent alors l'abandon du traitement antifongique envisag par le praticien sur l'pidmiologie et l'aspect clinique de la lsion, et retardent le diagnostic, dterminant ainsi un prjudice certain, notamment dans les cas de teignes et de lsions suppures (risque de dissmination l'entourage, cicatrices). Dautre part, l'application de cellophane adhsive n'a, en pratique, aucun rel intrt en mycologie. Au contraire, elle est souvent la cause de la fausse ngativit de l'examen. Les modalits du prlvement dpendentdelalsion,desonsige,desonaspect.Li'mportantestdercuprer,enchaquesiteprlev, un maximum de matriel pour un examen direct abondant, des cultures efficaces, ventuellement un nouvel examen direct et de nouvelles cultures en cas de « doute ». En pratique, suivant les diffrents types de lsions cutano-phanriennes, il est souhaitable d'obtenir : - une trentaine de squames (ou plus, si possible) prleves, au-dessus d'une bote de Petri, avec un scalpel mousse ou une curette, sur le relief vsiculeux priphrique dune lsion circine (le centre, squameux, est en voie de gurison), sur les taches dyschromiques dun probable pityriasis versicolor, en priphrie dune fissure interdigitoplantaire, … - au moins une quinzaine de cheveux ou poils parasits, prlevs la pince en exerant une lgretraction.Lespoilsparasitsn'offrentaucunersistance,alorsqui'lestinutiledi'nsistersurunpoil ne venant pas spontanment. Si la lsion est suppure, une gouttelette de « pus » sourd au niveau de l'ostiole, recueillir sur un couvillon humidifi avec du liquide physiologique strile. Au cours des teignes « endothrix », les cheveux sont trs fragiliss, augments de diamtre, casss trs
Facult de Mdecine Montpellier-Nmes
Module Intgr 5 Dermatologie
Bases et principes du diagnostic biologique des mycoses cutano-phanriennes et muqueuses
courts ou enfouis et contourns dans les squames. Lors des teignes microsporiques, les cheveux parasits sont souvent fluorescents sous rayonnement ultra-violet et casss quelques millimtres au-dessus du cuir chevelu (sensation de « petite brosse » au toucher), car soutenus par les gaines pithliales (aspect blanchtre). - un maximum de fragments d'ongles et de matire sous-unguale. En cas d'onychomycose sous-unguale, il faut recueillir, l'aide d'un scalpel et/ou d'une curette, toute la matire sous-unguale, jusqu' la limite de dcollement de la tablette, cette limite signant le front d'avance du Champignon (les derniers fragments prlevs renferment les filaments les plus jeunes). Seule la prsence de taches de leuconychie superficielle justifie le prlvement de fins copeaux raliss par grattage au scalpel de la surface de la tablette unguale, ou du matriel finement crayeux obtenu en creusantchaqueplaqueblanchtreavecunecurette.Lorsqui'lexisteunpri-onyxis,lerecueilauscalpeloulacurettedessquamesdupourtourdel'onglefaciliteli'ssuedepussouslebourreletsus-un ual, rlever l'couvillon. Le conditionnement et le transport de ces produits biologiques se font en rcipients striles (tubes, flacons, petites botes de Petri, …) bien ferms. Lajout de quelques gouttes de liquide physiologique strile lcouvillon est conseill pour viter la dessiccation. Les fragments de tissus (biopsies, pices opratoires) destins l'examen mycologique doivent tre conditionns dans du liquide physiologique strile, sans fixateur, totalement spars de ceux, fixs, destins l'anatomo-pathologiste. Dune manire gnrale, la longue survie sec et temprature ambiante des Champignons dans les squames, cheveux et poils, fragments dongles et de matire sous-unguale permet un envoi distance sans risque de dtrioration. Le produit biologique ainsi prlev sera ensuite partag en deux parties sensiblement gales par le laboratoire pour effectuer en parallle examen direct et culture. IV - EXAMEN DIRECT Il s'agit, bien videmment, de l'examen direct du matriel prlev, et non de l'examen microscopique des produits de la culture ! Dans le langage courant, cette vidence est pourtant loin d'en tre une pour tout le monde ... Cet examen direct, technique indispensable pour mettre en vidence le Champignon sous un « tat parasitaire », apporte en quelques minutes (alors que l'ventuelle croissance en culture et li'dentificationd'unChampignonpeuventprendreplusieurssemaines)lapreuveformelledunemycose. A elle seule, en effet, la positivit de lexamen direct permet dimpliquer un (ou plusieurs) Champignon(s) dans le processus pathologique en rvlant, par exemple, la prsence de Levures bourgeonnantes du genreCandida, ventuellement accompagnes de myclium, sur les muqueuses ou de filaments de Dermatophyte dans les squames, les fragments dongles … En cas de positivit de lexamen direct, le diagnostic de mycose sera bien videmment maintenu, mme si les cultures restent ultrieurement ngatives … ☞Pour en savoir plus Cette ngativit des cultures sexplique par laffaiblissement du Champignon du fait de l'anciennetdeli'nfestationoudetraitementsitratifsmaisinsuffisants.Ainsi,environletiersdesdiagnostics de mycose cutano-phanrienne, la moiti de ceux d'onychomycose des pieds, n'est port ue sur le seul examen direct !… ou sont souilles par d'autres spores « contaminantes » prsentes sur ou dans le matriel biologique prlev.
Facult de Mdecine Montpellier-Nmes
Module Intgr 5 Dermatologie
Bases et principes du diagnostic biologique des mycoses cutano-phanriennes et muqueuses
☞Pour en savoir plus Exemple de spores « contaminantes » : spores dePenicilliumspp. qui germent au contact du milieu de culture. Le myclium envahit alors la glose, inhibant la croissance du Champignon attendu, aussi bien ar com tition s atiale ue ar excrtion de molcules antifon i ues. A contrario, la croissance en culture, alors quun examen direct minutieux et approfondi est rest ngatif, de colonies de Champignons dont les spores sont connues pour tre prsentes en grand nombre ltat normal dans le milieu extrieur et/ou hberges naturellement par le patient, ne permet pas, elle seule, daffirmer la mycose. Un examen microscopique minutieux de la morphologie des lments fongiques dans les produits biologiques permet de prciser le(s) type(s) de Champignon(s) impliqu(s). Il oriente ainsi son (leur) identification ultrieure par cultures. De plus, la constatation de la coexistence de plusieurs types de myclium permet la dtection de frquentes associations ☞Pour en savoir plus Exemples dassociation : Dermatophyte + Levure dans les squames des lsions interdigitoplantaires ; Dermatophyte + opportuniste dans la matire sous-unguale lors donyxis « chroniciss » du fait de la non-efficacit de nombre d'antifon i ues sur les o ortunistes. Deux modalits dexamen direct peuvent tre mises en œuvre : IV.1 - Examen direct « frais » Lexamen direct « frais » se pratique directement sur le produit biologique, sans fixation ni coloration spcifique. Il est facilit par lutilisation dclaircissants (p. ex. : lactophnol d'Amann). Sont ainsi, par exemple, examins les appositions sur lame dcouvillons, les cheveux, poils et duvets. Examen direct « frais » levures bourgeonnantes (+/-myclium) de mucosits, …Candidaspp. … filaments intra-pilaires et spores de cheveux, poils, duvets Dermatophytes spores deMalassezia furfurintra-folliculaires … IV.2 - Examen direct aprs coloration Les principales colorations utilises en Mycologie (aprs fixation par 50% alcool - 50% ther) sont des « colorations aprs oxydation ». Lune dentre elles, la coloration en rose « fuchsia » fonc selon la technique de Hotchkiss-MacManus (HMM) est adapte de la coloration P.A.S. (acide periodique, ractif de Schiff) des histo-pathologistes. Elle est particulirement indique pour mettre en vidence les Levures (blastospores et filaments) et les filaments des Dermatophytes et de certains Champignons opportunistes (Scopulariopsis brevicaulis,Fusariumspp., …).
Facult de Mdecine Montpellier-Nmes
Module Intgr 5 Dermatologie
Bases et principes du diagnostic biologique des mycoses cutano-phanriennes et muqueuses
☞Pour en savoir plus En prsence d'acide priodique (du latinper: au-del, et du greciods: violet [do : iode] et non « priodique », du grecperi: autour de, etodos: chemin), les groupements hydroxyle des complexes polysaccharidiques des parois des cellules fongiques sont oxyds en aldhydes. Agissant comme des rducteurs, les aldhydes ainsi forms ragissent avec le ractif fuchsine-sulfureux de Schiff. Examen direct aprs coloration selon la technique de Hotchkiss-MacManus (HMM) levures bourgeonnantes (+/-myclium) de Candidaspp. squames spores et filaments deMalassezia furfur filaments de Dermatophytes … levures bourgeonnantes (+/-myclium) de fragments dongleCandidaspp. et matire sous-unguale filaments de Dermatophytes filaments de Champignons opportunistes … V - CULTURES Le but des cultures est le dveloppement et lisolement de colonies qui, une fois dnombres (notammentdanslecasdesLevures),permettrontli'dentificationdu(oudes)Champignon(s)impliqu(s).Lersultatdecetteidentificationdoittrecorrlli'mageobservel'examendirect.Autrement dit, le(s) Champignon(s) qui « pousse(nt) » doi(ven)t tre celui (ceux) attendu(s) d'aprs le rsultat de l'examen direct. V.1 - Isolement Lisolement se fait par ensemencements pratiqus de faon strile (prs d'un bec Bunsen), classiquement sur tubes de glose glucose (2 %) de Sabouraud, contenant des antibiotiques antibactriens et des vitamines (en ayant soin de conserver une quantit suffisante de matriel biologique pour l'examen direct sil na pas encore t effectu). L'adjonction de cycloheximide (Actidione)dansunepartiedesmilieuxpermetdi'nhiberlacroissanced'ventuelsChampignonscontaminants (mais, attention ! il inhibe galement celle de certaines Champignons impliqus en pathologie humaine :Candida glabrata,Cryptococcus neoformans, …) et d'utiliser la rsistance ou la sensibilitduChampignonceproduitcommecritredi'dentification.☞Pour en savoir plus Les exigences mtaboliques (besoins en oxygne, …) de nombreux Champignons impliqus en pathologie cutano-phanrienne ncessitent toutefois l'utilisation de gloses de culture conditionnes : - en grands tubes contenant au moins 20 ml de milieu refroidi inclin, de faon ce que la pente soit la plus longue possible, s'arrtant 3 cm du bouchon, pour une aration maximale, le bouchon tant viss fond; - en botes de Petri de 9 cm de diamtre, contenant 30 ml de milieu our o timiser la lace dis onible our les colonies fon i ues.
Facult de Mdecine Montpellier-Nmes
Module Intgr 5 Dermatologie
Bases et principes du diagnostic biologique des mycoses cutano-phanriennes et muqueuses
Les milieux ainsi ensemencs sont conservs au moins une semaine 27 C (et 37 C pour les produits biologiques d'origine profonde : biopsies, pices opratoires). En cas de positivit, le dveloppement : - en deux quatre jours (parfois davantage, notamment quand le patient est dj trait par antifongiques), de colonies blanchtres, crmeuses, paisses, luisantes suggrera une (ou des) Levure(s), notamment du genreCandida. Les colonies sont dnombres, habituellement de faon semi-quantitative (de « rares » « trs nombreuses ») ; - en trois huit jours, de colonies en nappe de consistance et de teinte variables (bleute, verte, ocre, rose, blanche, …) orientera vers lesAspergillus,Penicillium,Fusarium, et autres Champignons filamenteux, … ; - en une trois semaines, parfois plus, de colonies dont la forme, la consistance et la couleur, variables, seront des critres macroscopiques didentification des Dermatophytes. ☞Pour en savoir plus En cas de suspicion de dermatophytose, les milieux devront donc tre conservs au moins trois semaines avant de considrer les cultures comme n atives ! Ces dlais de croissance, vritables critres didentification des Champignons, conditionnent, bien entendu, le dlai de rponse dfinitive de la part du Laboratoire. Par ailleurs, la ngativit des cultures (souvent du fait de prises antrieures d'antifongiques) ni'nfirmebienvidemmentpaslediagnostic(enparticulierquandl'examendirectestpositif)etn'aaucune valeur de gurison dune mycose prcdemment prouve tant que l'examen direct reste positif. V.2 - Identification Li'dentificationdesespcesdeLevuresoudeChampignonsfilamenteuxpermetdadapterlathrapeutique et, souvent, de prciser le mode de contamination. Elle se fait sur des caractres morphologiques (macro- et microscopiques) et/ou physiologiques (vitesse de croissance, besoins vitaminiques, utilisation et fermentation des sucres, ...). V.2.1 - Identification des Levures Laphasedi'dentificationdesLevures,notammentdecellesdugenreCandida, doit, dsormais, imprativement tenir compte de l'ventualit de l'association de plusieurs espces dans un mme chantillon biologique. ☞Pour en savoir plus Ces associations sont lies la fois l'augmentation constante du nombre de patients atteints de pathologies et/ou soumis des traitements dterminant la prolifration des Levures, et la prescription au long cours d'antifongiques favorisant des Levures naturellement peu sensibles ces molcules . ex.Candida labrata,C. krusei. Classiquement, la dtection de ces associations passe par un repiquage sur milieu de Sabouraud contenant du triphnyl-2,3,5-ttrazolium, substance que chaque espce est plus ou moins apte rduire en fournissant un compos color. Les colonies prenant des teintes diffrentes (du blanc au rouge violac) doivent tre considres comme autant de souches despces diffrentes, qui seront repiques et identifies sparment. Rcemment, la dtection de ces associations a pu bnficier de la mise au point de milieux contenant des chromognes, teintant plus ou moins les
Facult de Mdecine Montpellier-Nmes
Module Intgr 5 Dermatologie
Bases et principes du diagnostic biologique des mycoses cutano-phanriennes et muqueuses
colonies de couleurs particulires certaines souches, sans pour autant permettre leur identification spcifique prcise. Li'dentificationdeCandida albicanspasse par la rvlation d'au moins un des deux caractres suivants : formation de chlamydospores caractristiques, 24 48 heures aprs repiquage en stries profondes (anarobiose) sur des milieux pauvres en sucres et tensio-actifs (PCB = Pomme de terre -Carotte - Bile; RAT = Rice - Agar -Tween); filamentation en srum (= blastse) 37 C en quatre heures au maximum. Li'dentificationspcifiquedesautresespcesdeCandidal'tude de certaines ncessite proprits physiologiques de la Levure, en particulier son aptitude (actuellement value en « galeries » commercialises) assimiler divers sucres (« auxanogramme ») et les fermenter («zymogramme»).Li'dentificationspcifiqueparagglutinationdeparticulesinertessensibilisespardes anticorps monoclonaux est en cours d'valuation. Outre par sa mise en vidence ltat parasitaire par lexamen direct, il est important d'valuerli'mplicationrelledanslapathologied'uneLevureisoled'unchantillonbiologiqueparlenombre de colonies dveloppes en culture et par son isolement plusieurs reprises dans le mme type de matriel biologique. Cette phase disolement et didentification de la (des) Levure(s) dure au minimum trois jours et peut demander une semaine. V.2.2 - Identification des Champignons filamenteux Lemilieuglucosdi'solementdeSabouraudfavoriselacroissancedumycliumdesChampignons filamenteux, mais non leur sporulation. Or, en pratique, la morphologie microscopique des organes de reproduction asexue est le critre majeur didentification spcifique de ces Champignons.Ilestdoncncessairederepiquerlescoloniessurdesmilieuxdi'dentificationnonglucoss qui stimuleront la fructification des organes sporignes et des spores (p. ex. micro- et macroconidies des Dermatophytes). ☞Pour en savoir plus Les principaux milieux didentification utiliss en pratique courante par les mycologues sont : le milieu « Pomme de terre-Carotte » (Dermatophytes, Dmatiaces, …), le milieu Lactritmel de Borelli (Dermatophytes,Aspergillus, …), le milieu de Czapek-Dox (Aspergillus), la glose au malt (Champignons filamenteux opportunistes) et la glose au Mas ou corn meal agar (Dermatophytes et Cham i nons filamenteux o ortunistes . Les principaux critres didentification des Champignons filamenteux sont : * le dlai dapparition des colonies et la vitesse de leur croissance ; * la thermo tolrance du Champignon et son optimum thermique de croissance ; * les caractres macroscopiques des colonies : forme (plane, bombe, crbriforme, …), consistance (poudreuse, duveteuse, cotonneuse, dure, lastique, …), couleur (recto et verso), … ; * les caractres microscopiques : myclium (diamtre, rgularit, ramifications, arthrospores, chlamydospores, …), organes sporignes (conidiophores et vsicules, phialides, …), spores (abondance, dimensions, morphologie, coloration, segmentation, …), ornementations du myclium (nœuds, vrilles, chandeliers, …).
Facult de Mdecine Montpellier-Nmes
