MINISTÈRE DE LA JEUNESSE DE L'ÉDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE
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2004
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MINISTÈRE DE LA JEUNESSE, DE L'ÉDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ÉCOLE PRATIQUE DES HAUTES ÉTUDES Sciences de la Vie et de la Terre MÉMOIRE Présenté par Nicole LUCIEN Pour l'obtention du diplôme de l'École Pratique des Hautes Études LE SYSTÈME DE GROUPE SANGUIN KIDD (JK) Identification d'un nouveau mécanisme à la base du phénotype Jknul Antigénicité et Propriétés fonctionnelles du transporteur d'urée hUT-B1/Jk Soutenu le 14 Septembre 2004 devant le jury suivant : Mr Andràs PALDI Président Mme Flore RENAUD-PAÏTRA Rapporteur Mr Philippe ROUGER Examinateur Mr Pascal BAILLY Examinateur Mme Lise BANKIR Examinateur Laboratoire EPHE de Génétique Moléculaire et Physiologique Université de Versailles/Saint-Quentin , CNRS UPRES- A8087 Bâtiment Fermât, 45 avenue des Etats-Unis 78035 VERSAILLES Cedex Directeur : Pr Bernard MIGNOTTE E-mail : Laboratoire de Biochimie et Génétique INTS-INSERM U76 Institut National de la Transfusion Sanguine 6, rue Alexandre Cabanel 75015 PARIS Directeur : Dr Jean-Pierre CARTRON E-mail : EPHE Banque de Monographies SVT 1
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- mémoire
MINISTÈRE DE LA JEUNESSE, DE L'ÉDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ÉCOLE PRATIQUE DES HAUTES ÉTUDES Sciences de la Vie et de la Terre MÉMOIRE Présenté par Nicole LUCIEN Pour l'obtention du diplôme de l'École Pratique des Hautes Études LE SYSTÈME DE GROUPE SANGUIN KIDD (JK) Identification d'un nouveau mécanisme à la base du phénotype Jknul Antigénicité et Propriétés fonctionnelles du transporteur d'urée hUT-B1/Jk Soutenu le 14 Septembre 2004 devant le jury suivant : Mr Andràs PALDI Président Mme Flore RENAUD-PAÏTRA Rapporteur Mr Philippe ROUGER Examinateur Mr Pascal BAILLY Examinateur Mme Lise BANKIR Examinateur Laboratoire EPHE de Génétique Moléculaire et Physiologique Université de Versailles/Saint-Quentin , CNRS UPRES- A8087 Bâtiment Fermât, 45 avenue des Etats-Unis 78035 VERSAILLES Cedex Directeur : Pr Bernard MIGNOTTE E-mail : Laboratoire de Biochimie et Génétique INTS-INSERM U76 Institut National de la Transfusion Sanguine 6, rue Alexandre Cabanel 75015 PARIS Directeur : Dr Jean-Pierre CARTRON E-mail : EPHE Banque de Monographies SVT 1
- phénotype rare
- protéine
- transfectants k562 exprimant la protéine hut-b1 par spectrophotométrie en flux
- pcr polymerase
- chain reaction
- paire de bases pcmbs para-chloromercuribenzènesulfonate
- transporteur d'urée
MINISTÈRE DE LA JEUNESSE, DE L’ÉDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE
ÉCOLE PRATIQUE DES HAUTES ÉTUDES Sciences de la Vie et de la Terre MÉMOIRE Présenté par Nicole LUCIEN Pour l’obtention du diplôme de l’École Pratique des Hautes Études LE SYSTÈME DE GROUPE SANGUIN KIDD (JK) Identification d’un nouveau mécanisme à la base du phénotype Jk nul Antigénicité et Propriétés fonctionnelles du transporteur d’urée hUT-B1/Jk
Soutenu le 14 Septembre 2004 devant le jury suivant : Mr Andràs PALDI Président Mme Flore RENAUD-PAÏTRA Rapporteur Mr Philippe ROUGER Examina eur t Mr Pascal BAILLY am ateur Ex in Mme Lise BANKIR Examinateur Laboratoire EPHE de Génétique Moléculaire et Physiologique Université de Versailles/Saint-Quentin , CNRS UPRES- A8087 Bâtiment Fermât, 45 avenue des Etats-Unis 78035 VERSAILLES Cedex Directeur : Pr Bernard MIGNOTTE E-mail : mignotte@genetique.uvsq.fr Laboratoire de Biochimie et Génétique INTS-INSERM U76 Institut National de la Transfusion Sanguine 6, rue Alexandre Cabanel 75015 PARIS Directeur : Dr Jean-Pierre CARTRON E-mail : cartron@idf.inserm.fr
Directeur de stage : Dr Pascal BAILLY E-mail : bailly@idf.inserm.fr RÉSUMÉ Le transporteur d’urée du globule rouge humain (hUT-B1) est le produit du gène de groupe sanguin Kidd/Jk caractérisé par les allèles codominants JK*A et JK*B qui définissent trois phénotypes courants Jk(a+b+), Jk(a+b-), Jk(a-b+) et un phénotype rare Jk(a-b-) ou Jk nul . Premièrement, nous avons déterminé la base moléculaire du phénotype Jk nul d’une femme tunisienne, homozygote pour l’allèle JK*A , possédant un allo-anticorps anti-Jk3 dans son sérum. Une délétion génomique de 1,6 kb comprenant les exons 4 et 5 du gène JK a été détectée. Le séquençage du transcrit a confirmé que les exons 4 et 5 sont absents et qu’ils sont remplacés par une séquence intronique de 136 pb localisée en amont de l’exon 4. L’analyse par transcription-traduction in vitro indique l’absence de synthèse de protéine à partir de l’ADNc Jk(D4,5) due à la perte du codon d’initiation de la traduction présent dans l’exon 4. C’est la première identification d’une délétion partielle dans le gène JK à l’origine du phénotype Jk nul . Dans un second temps, nous avons démontré que la substitution Asp/Asn en position 280 est bien à la base des réactivités antigéniques Jk a et Jk b et que la chaîne N -glycannique liée à l’Asn-211 porte des déterminants ABO. Nous avons également mis en évidence que les extrémités N- et C-terminales de la protéine ont une orientation intracytoplasmique. L’ensemble de ces résultats est en accord avec le modèle topologique prédictif de la protéine hUT-B1 à dix domaines transmembranaires. L’étude du transport d’urée dans des transfectants K562 exprimant la protéine hUT-B1 par spectrophotométrie en flux interrompu nous a permis de confirmer que ce transport n’est pas affecté par le polymorphisme JK*A/JK*B et qu’il est inhibé efficacement par le pCMBS dans ce contexte érythroïde. La mutagénèse des deux cystéines C151 et C236 montre que, séparément, elles ne sont pas impliquées dans l’inhibition par le pCMBS. MOTS CLÉS : groupe sanguin, système Kidd, phénotype Jk nul , transport d’urée
Abréviations INTRODUCTION
TABLE DES MATIÈRES
I. Le globule rouge et sa membrane plasmique II. Les antigènes de groupe sanguin III. Le système de groupe sanguin Kidd III. 1. Les antigènes Jk a et Jk b III. 2. Le phénotype rare Jk(a-b-) ou Jk nul III. 3. Relation entre le système de groupe sanguin Kidd et le transporteur d’urée IV. Identification du transporteur d’urée du globule rouge IV. 1. Les différents types de transport membranaire érythrocytaire IV. 2. Le transport d’urée au niveau du globule rouge IV. 3. Caractérisation moléculaire du transporteur d’urée du globule rouge : hUT-B1/Jk V. Structure du gène Kidd/JK VI. Bases moléculaires du phénotype récessif Jk(a-b-) VII. Expression tissulaire du transporteur d’urée hUT-B1 VIII. Une nouvelle famille de gènes
ABRÉVIATIONS ADNc Acide désoxyribonucléique complémentaire AEBSF 4-(2aminoethyl)-benzènesulfonylfluoride ARNc Acide ribonucléique complémentaire AA Amorce antisens AS Amorce sens AQP Aquaporine AMV Avian megalovirus BFU-E "Burst-forming unit-erythroïd" BSA Bovine Serum Albumin (albumine sérique bovine) b -ME b -mercaptoéthanol CFU-E “Colony-forming unit-erythroïd cpm coups par minute a dCTP-[P 32 ] déoxycytidine 5’-[ 32 P] triphosphate ddNTP didéoxynucléotide triphosphate D.O. Densité Optique EDTA Acide éthylènediaminetétra-acétique G q GigaBecquerel B IgG Immunoglobuline G kb kilobase kDa kiloDalton l longueur d’onde de la lumière min minute mosmol milliosmoles pb paire de bases pCMBS para -chloromercuribenzènesulfonate PBS Phosphate Buffer Saline (tampon phosphate)
PCR Polymerase Chain Reaction PCR-RFLP Restriction Fragment Lenght polymorphism-Polymerase Chain Reaction PM Poids moléculaire P’ f Perméabilité apparente à l’eau P’ urée Perméabilité apparente à l’urée RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism RT-PCR Reverse transcriptase-Polymerase Chain Reaction SDS Sodium dodécyl sulfate SDS-PAGE SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis s seconde ROV Vésicule “Right side-out IOV Vésicule “Inside-out TO-PRO-1 Quinolinium,4[(3-methyl-2(3H)benzothiazoPylidene)méthyl]-1-[3-trimethylammonio)propyl]diodide Tris Tris (hydroxyméthyl amino méthane) Tween 20 Polyoxyéthylène-sorbitan monolaurate UT "Urea Transporter" (transporteur d’urée) v/v volume à volume wt “wild-type (sauvage)
INTRODUCTION
I. Le globule rouge et sa membrane plasmique Le globule rouge (diamètre~7 m m) est une cellule anuclée remplie d'hémoglobine dont le rôle principal est de véhiculer l’oxygène à travers tout l’organisme et d’évacuer le gaz cxarbonique. La structure de sa membrane permet une diffusion de l’oxygène dans les tissus et sa forme biconcave lui assure une large surface d’échanges gazeux et ioniques. Cette propriété permet aux globules rouges de passer dans la microcirculation (diamètre~1 m m) sans être endommagés. Les globules rouges, comme toutes les autres cellules du sang dérivent de précurseurs présents uniquement dans la moelle osseuse chez l’homme adulte normal qui constitue le tissu hématopoïétique. La particularité de ce tissu est d’être un système continu de différenciation à partir de cellules souches pluripotentes qui assurent l’hématopoïèse tout au long de la vie. Les cellules souches sont capables de s’autorenouveler et de se différencier pour se déterminer vers une seule lignée cellulaire, la lignée érythroïde par exemple. Les progéniteurs déterminés issus des cellules souches sont irréversiblement engagés vers une (ou deux) lignée cellulaire, par exemple les BFU-E « Burst Forming Unit -erythroïd » et CFU-E « Colony Forming Unit -erythroïd » pour la lignée érythroïde. La maturation terminale de ces cellules s’accompagne de nombreuses mitoses et conduit à une amplification importante des cellules terminales matures passant dans la circulation sanguine. À titre d’exemple, la production de globules rouges (durée de vie ~120 jours) est de l’ordre de 2 x 10 11 cellules / jour permettant d’assurer une concentration dans le sang d’environ 5 x 10 6 cellules / mm 3 . La membrane du globule rouge est constituée de 52% de protéines, 40% de lipides et 8% de
glucides (Steck et al. 1974). Les structures glucidiques présentes sur la surface externe de la membrane sont associées par une liaison covalente à des protéines ou à des lipides. Les lipides sont principalement des phospholipides entre lesquels s’intercalent des molécules de cholestérol et des glycolipides (Lux et al. 1995). Ils se répartissent selon le modèle de Singer et Nicolson (Singer et al. 1972) en une bicouche où sont enchassées des protéines réparties en 2 classes : les protéines intégrées fortement ancrées dans la bicouche lipidique comme la Bande 3 (Lux et al. 1989), les glycophorines (Cartron et al. 1992). les protéines périphérique s associées aux protéines intégrées ou aux lipides de la face cytoplasmique de la membrane de la cellule constituent le cytosquelette membranaire responsable de la forme et de la déformabilité du globule rouge. La spectrine, l’actine, l’ankyrine et la protéine 4.1 sont les principales protéines du cytosquelette érythrocytaire (Delaunay et al. 1990).
II. Les antigènes de groupe sanguin La membrane érythrocytaire porte à sa surface les antigènes de groupe sanguin dont la caractérisation a permis de mieux comprendre les problèmes survenant en transfusion sanguine (Cartron et al. 2001). Depuis la découverte en 1901 du système ABO par Landsteiner, plus de 280 antigènes de groupe sanguin ont été identifiés (Daniels et al. 2003) et sont regroupés en 29 systèmes se répartissant en deux grandes catégories : les antigènes de nature glucidique et les antigènes de nature polypeptidique. Les antigènes ABO, P, H et Lewis appartiennent à la 1 ère catégorie : ils sont constitués de structures glucidiques associées à des protéines ou à des lipides. Les gènes responsables de ces groupes sanguins codent des glycosyltransférases, protéines résidentes de l’appareil de Golgi (Watkins et al. 1980). Les antigènes de nature protéique, produits primaires de gènes, sont exprimés par des protéines comportant soit un seul domaine transmembranaire comme par exemple les glycophorines (A, B et C), les protéines LW, Luthéran (Lu), soit plusieurs domaines transmembranaires comme les polypeptides Rh, Duffy (Fy), Kidd (Jk). D’autres antigènes sont portés par des protéines liées à la membrane du globule rouge par une ancre glycosylphosphatidylinositol comme les protéines Dombrock (Do) et Cartwright (Yt). Les molécules portant ces antigènes ont des fonctions biologiques variées. Elles ont pu être classées en 5 catégories selon leur fonction connue ou prédictive : des transporteurs et canaux des récepteurs pour différents ligands, virus, parasites et bactéries des molécules impliquées dans des mécanismes d’adhérence entre cellules ou des interactions avec des protéines de la matrice extracellulaire des protéines enzymatiques
des protéines de structure qui contribuent au maintien de l’architecture membranaire. Toutefois certaines molécules peuvent posséder des propriétés communes à plusieurs catégories. Ces molécules sont également présentes dans des tissus d’origine non-érythroïde.[Cartron, 2001 #59][Cartron, 2001 #59] Du fait de leur présence à la surface externe de la membrane des hématies, elles peuvent être à l’origine de conflits immunologiques lors de transfusion sanguine, de transplantation d’organes, de grossesse aboutissant à des anémies hémolytiques néo-natales. De nombreux antigènes sont aussi des récepteurs pour des virus, des bactéries et des parasites ce qui laisse à penser que ces antigènes pourraient jouer un rôle direct dans la pathogénèse des maladies infectieuses. Enfin, l’absence de certains antigènes peut entraîner des anomalies morphologiques ou fonctionnelles suggérant également que certains antigènes jouent un rôle crucial dans l’intégrité de la membrane érythrocytaire. (Cartron et al. 1998). III. Le système de groupe sanguin Kidd
III. 1. Les antigènes Jk a et Jk b En 1951, un anticorps de spécificité inconnue a été mis en évidence dans le sérum de Mme Kidd à la suite d’une incompatibilité fœto-maternelle, cet alloanticorps a été nommé anti-Jk a (Allen et al. 1951; Race 1951). L’anticorps anti-Jk b fut découvert ultérieurement chez un patient lors d’une réaction transfusionnelle (Plaut 1953). Le système de groupe sanguin Kidd (JK) est défini par deux allèles codominants JK*A et JK*B (Race 1951) de fréquence génique 0,52 et 0,48 respectivement, dans la population caucasienne. Ces deux allèles définissent trois phénotypes courants Jk(a+b+), Jk(a+b-), Jk(a-b+) de fréquences phénotypiques respectives : 0,50, 0,28 et 0,22 et un phénotype rare Jk(a-b-) ou Jk nul (Pinkerton et al. 1959). Des études de population ont montré que l’antigène Jk a est présent chez 93% des noirs, 77% des blancs et 52% des chinois (Roy-Choudhury et al. 1988). Un effet de dose peut être observé avec les anticorps anti-Jk a et anti-Jk b ce qui permet de distinguer les individus hétérozygotes des homozygotes (Humphrey et al. 1976). Les antigènes Kidd sont détectés dès la 10 ème semaine de la grossesse et bien exprimés à la naissance (Toivanen et al. 1973). Ils sont absents des lymphocytes et des plaquettes (Dunstan 1986). Des formes solubles n’ont pas été détectées dans le plasma, les urines, la salive et le lait maternel contrairement à d’autres antigènes de groupe sanguin. Ils apparaissent tardivement au cours de la différenciation érythroïde, entre le 10 ème et le 14 ème jour d’une culture de progéniteurs érythroïdes du sang périphérique (Bony et al. 1999). Le nombre de sites antigéniques Jk a été estimé à 11300 ± 3100 sites par globule rouge au moyen d’une technique de microscopie électronique utilisant des anticorps marqués à la ferritine (Masouredis et al. 1980). Les antigènes sont détruits par chauffage à 56°C mais ils résistent aux protéases (Daniels et al. 1992) et aux agents réducteurs de ponts di-sulfures (Branch et al. 1982), ce qui suggère qu’ils sont portés par une protéine enfouie dans la bicouche lipidique. Une masse moléculaire apparente de 45 kDa a été déterminée par immunoprécipitation des
antigènes Kidd sur membrane de nylon et SDS-PAGE (Sinor et al. 1987).
III. 2. Le phénotype rare Jk(a-b-) ou Jk nul Le phénotype Jk(a-b-) a été décrit pour la 1 ère fois chez une femme d’origine philipine ayant des ancêtres chinois et hispanique, à la suite d’une réaction hémolytique post-transfusionnelle (Pinkerton et al. 1959). Ce phénotype a ensuite été identifié principalement dans les populations originaires d’Asie et de Polynésie avec une fréquence de 0,89% (Henry et al. 1995) mais aussi dans certaines populations restreintes du Brésil (Silver 1960), de Hawaï (Yokoyama et al. 1967), en Inde (Roberts et al. 1980) et au Japon (Okubo et al. 1986). Dans la population caucasienne, le phénotype Jk nul est plus rare : quelques cas ont été décrits dans quelques familles, en France (Habibi et al. 1976), en Australie (Klarkowski 1984) et en Finlande avec une fréquence de 0,03% (Irshaid et al. 2002). Lors d’études familiales, plusieurs types de phénotype nul ont été décrits : le phénotype Jk(a-b-) de type récessif qui résulte de l’homozygotie d’un allèle JK silencieux au locus Kidd. La transmission d’un allèle silencieux JK a été montré par Habibi et al. (1976) ainsi que par la détection sérologique de la simple dose allélique JK*A ou JK*B (Humphrey et al. 1976). Le sérum des individus de phénotype Jk(a-b-) de type récessif contient un anticorps anti-Jk3 capable d’agglutiner toutes les hématies à l’exception des hématies de sujets Jk nul . L’antigène JK3 est distinct des antigènes Jk a et Jk b (Woodfield et al. 1982). le phénotype Jk(a-b-) de type dominant : l’analyse sérologique de sujets japonais de phénotype Jk(a-b-) révèle une diminution sévère de l’expression des antigènes Kidd à la surface de leurs globules rouges (Okubo et al. 1986). L’anticorps anti-Jk3 est faiblement exprimé dans leur sérum (Moulds 1995). Ces observations suggèrent l’existence d’un gène inhibiteur dominant In(Jk) par analogie avec le gène dominant inhibiteur In(Lu) responsable du phénotype Lu nul (Taliano et al. 1973). Ce gène est indépendant du locus Kidd et agit à simple dose. une forme transitoire de phénotype Jk(a-b-) a été décrite chez une patiente Russe (Issitt et al. 1990). Le phénotype de cette femme a changé à deux reprises sur une période de 24 mois. Lorsque ses hématies ont été phénotypées Jk(a-b-), l’anti-JK3 était présent dans son sérum, en revanche lorsque son phénotype était Jk(a+b-), un anti-Jk b et un anti-Jk3 étaient détectés dans son sérum. Cette situation réversible n’est pas expliquée à ce jour.
III. 3. Relation entre le système de groupe sanguin Kidd et le transporteur d’urée En 1982, il a été découvert fortuitement que les hématies d’individus Jk nul mises en présence d’urée 2M sont capables de résister à la lyse pendant 15 à 30 mn alors que des hématies « Jk » ; Jk - ; Jk -b+ com l en
1 à 2 mn (Heaton et al. 1982). Pour les individus hétérozygotes pour l’allèle silencieux JK , le temps de lyse des érythrocytes est intermédiaire (Edwards-Moulds et al. 1988). Des mesures de flux d’urée ont montré que les hématies Jk(a-b-) sont dépourvues de transport facilité d’urée et que l’urée traverse la membrane simplement par diffusion passive (Frohlich et al. 1991). La déficience du transport facilité de l'urée dans les globules rouges des individus de phénotype Jk(a-b-) a suggéré l’existence d’une relation entre le système de groupe sanguin Kidd et le transport d’urée dans ces cellules. IV. Identification du transporteur d’urée du globule rouge IV. 1. Les différents types de transport membranaire érythrocytaire Les hématies possèdent une membrane semi-perméable à l’eau et aux solutés qui permet de maintenir des concentrations différentes de soluté dans le cytoplasme et dans le milieu extracellulaire. Certaines substances diffusent simplement à travers la bicouche lipidique afin d’équilibrer leur concentration de part et d’autre de la membrane : il s’agit de diffusion passive selon une cinétique linéaire. D’autres molécules traversent la membrane plasmique par diffusion facilitée avec une vitesse initiale très élevée mais saturable. Dans ce cas, on distingue deux types de protéines permettant aux solutés de traverser la membrane : les transporteurs qui se lient aux solutés pour leur permettre de traverser la membrane et les canaux protéiques qui créent des pores dans la membrane pour laisser passer les solutés. Parfois les hématies doivent transporter des molécules à l’encontre du gradient de concentration, elles développent alors un système de transport actif en utilisant des transporteurs couplés à une source d’énergie (Alberts et al. 1994) La membrane des globules rouges comporte de nombreux transporteurs associés ou non à des antigènes de groupe sanguin : la Bande 3, échangeur d’anions (Tanner et al. 1988) la protéine 4.5, transporteur de glucose (Whitfield et al. 1985) l’aquaporine 1 (AQP-1), canal hydrique (Agre et al. 1995) l’aquaporine 3, transporteur de glycérol (Roudier et al. 1998) le complexe Rh, transporteur de NH 3 / NH 4+ (Hemker et al. 2003) de nombreux transporteurs de cations (Brugnara 1997)
IV. 2. Le transport d’urée au niveau du globule rouge Chez l’homme, l’urée est le principal produit du catabolisme des protéines. Elle est produite majoritairement dans le foie au cours du cycle de l’ornithine par action de l’arginase mais aussi dans le rein et le cerveau (Reddi et al. 1975). Elle est éliminée dans les urines par excrétion rénale. Une petite partie est hydrolysée dans le tractus intestinal et l’azote produit est recyclé en acides aminés et en urée (Langran et al. 1992). L’urée, molécule de petite taille (PM = 60), très soluble dans l’eau, peut donc être fortement concentrée dans l’urine sans précipiter. Elle diffuse lentement à travers les membranes cellulaires
du fait de sa faible solubilité dans les lipides. Dans les globules rouges, la perméabilité à l’urée de la membrane plasmique est élevée et la vitesse d’équilibration des concentrations d’urée entre les milieux intra- et extracellulaire suggère la présence de molécule facilitant le transport d’urée. Dans l’urine, la concentration de l’urée est 100 fois plus élevée que dans le plasma. Dans le rein qui excrète l’urée sous forme concentrée, un transport facilité de l’urée est nécessaire pour minimiser les variations volumiques encourues par les globules rouges lors de leur traversée de la medulla rénale hypertonique (Macey et al. 1988). Dans la papille rénale, la concentration en urée étant très élevée, le transport facilité de l’urée permet aux hématies d’éviter une diminution de volume par perte en eau via l’aquaporine-1. A l’opposé, il permet aux globules rouges chargés d’urée qui remontent par les vasa recta ascendants vers le cortex de relarguer rapidement l’urée intracellulaire pour prévenir l’augmentation de volume. Le transport d’urée érythrocytaire contribuerait également au processus de concentration des urines en alimentant la medulla rénale en urée. Ce transport facilité d’urée est saturable à des fortes concentrations d’urée, ne nécessite pas d’énergie et n’a lieu qu’en présence d’une différence de concentration favorable à la diffusion. Dans le globule rouge, il est inhibé par la phlorétine, par des analogues de l’urée comme la thiourée et le pCMBS (Hunter 1970). IV. 3. Caractérisation moléculaire du transporteur d’urée du globule rouge : hUT-B1/Jk A la suite d’une tentative infructueuse de clonage de la protéine portant les antigènes Kidd (Frohlich et al. 1991), le premier transporteur d’urée (UT2) a été cloné par expression dans des ovocytes, d’ARNm extraits de la papille rénale de lapin (You et al ., 1993) Par homologie avec UT2, notre laboratoire a isolé à partir d’une banque d’ADNc de moelle osseuse humaine, un ADNc (clone HUT11) codant le transporteur d’urée des globules rouges humains dont la séquence peptidique présente 63% d’identité avec le transporteur UT2 (Olivès et al. 1994). L’étude fonctionnelle de HUT11 dans des ovocytes de Xénope a montré que le polypeptide transporte sélectivement l’urée et que ce transport est inhibé par la phlorétine et le pCMBS comme il a été décrit précédemment pour le transporteur d’urée du globule rouge (Brahm 1983). En 1995, il a été établi que le groupe sanguin Kidd et le transporteur d’urée étaient portés par la même molécule (Olivès et al. 1995). Tout d’abord, par hybridation in-situ , le gène codant la protéine hUT-B1 a été colocalisé avec le locus du gène de groupe sanguin Kidd sur le chromosome 18 dans la région q12-q21 (Geitvik et al. 1987). Dans un second temps, des expériences de transcription-traduction in vitro ont montré que l'ADNc HUT11 dirigeait la synthèse d'une protéine de 36 KDa immunoprécipitée par l'anticorps humain anti-Jk3. Le même anticorps immunoprécipite, à partir d'hématies phénotypées Jk-positives et non d’hématies Jk(a-b-), un composé protéique de taille identique après N -déglycosylation. Enfin un anticorps de lapin dirigé contre l'extrémité N-terminale du polypeptide codé par HUT11 réagit en immunoblot avec une protéine de 46-60 kDa présente sur toutes les hématies humaines à l'exception des hématies Jk(a-b-).
Postérieurement, notre équipe a isolé un nouveau clone appelé HUT11A à partir d’ARNs d’érythroblastes humains Jk-positifs (Sidoux-Walter et al. 1999). L’analyse de la séquence de l’ADNc HUT11A montre qu’il est distinct de HUT11 par la substitution Lys44Glu et par la présence de deux motifs ValGly (au lieu de trois pour HUT11). L’analyse par PCR-RFLP de l’ADN génomique de 126 donneurs non-apparentés et les expériences de protection des ARNs aux ribonucléases ont confirmé que le gène JK code le polypeptide HUT11A qui comporte 389 acides aminés et seulement deux motifs ValGly (Sidoux-Walter et al. 1999). Ainsi la substitution en position 44 correspond vraisemblablement à un polymorphisme de population et la présence d’un motif ValGly supplémentaire dans le clone initialement identifié (HUT11) pourrait résulter d’un allèle rare présent chez l’individu dont la moelle osseuse a servi à réaliser la banque d’ADNc utilisée. L’analyse fonctionnelle de la protéine codée par l’ADNc HUT11A (2 motifs ValGly) exprimée à un taux physiologique dans des ovocytes de Xénope a montré qu’elle transporte sélectivement l’urée et que ce transport est faiblement inhibé par le pCMBS (Sidoux-Walter et al. 1999). Ce clone HUT11A est donc le transporteur d’urée « physiologique » du globule rouge et il a été renommé hUT-B1 (human Urea Transporter de type B pour l’origine érythroïde) d’après la nomenclature des transporteurs d’urée (Sands et al. 1997). La base moléculaire du polymorphisme JK*A/JK*B a été déterminée (Olivès et al. 1997) : elle résulte d'une transition nucléotidique G838A qui se traduit par la substitution Asp280Asn. Ce polymorphisme nucléotidique étant associé à un polymorphisme de restriction Mnl I, un test de génotypage JK*A/JK*B par PCR-RFLP a été développé et a permis de montrer qu’il n’existe aucun lien génétique entre le locus Kidd et le diabète insulinodépendant contrairement aux études antérieures établissant une éventuelle relation (Davies et al. 1994). hUT-B1 code donc une protéine de 389 acides aminés qui comporte 10 cystéines dont 7 sont conservées à la même position que dans UT2, 3 sites de N -glycosylation mais il ne possède pas de sites de phosphorylation pour les protéines kinases A et C. L’analyse comparative des séquences des transporteurs d’urée de différentes espèces comme hUT-B1, rUT-A2 (rat) et oUT-A2 (lapin) a mis en évidence que chaque molécule est composée de deux régions présentant environ 30% d’identité résultant d’une duplication interne. La séquence LPxxTxPF a été identifiée comme « signature » de la famille des transporteurs d’urée (Rousselet et al. 1996). V. Structure du gène Kidd/JK En 1998, la structure du gène JK a été déterminée au laboratoire (Lucien et al. 1998). Le gène JK est organisé en 11 exons répartis sur environ 30 kb d’ADN. La protéine mature de 389 acides aminés est codée par les exons 4 à 11. Le site d’initiation de la transcription est localisé 335 pb en amont du site d’initiation de la traduction situé dans l’exon 4. La région située en amont du site d’initiation de la transcription révèle un promoteur de type érythroïde. L'analyse de la région 3' non-traduite met en évidence plusieurs sites de polyadénylation à l’origine des deux transcrits
de 2,2 kb et 4,5 kb détectés dans les tissus érythroïdes. VI. Bases moléculaires du phénotype récessif Jk(a-b-) La détermination de la structure du gène JK a permis d’identifier les bases moléculaires du phénotype Jk nul . Le phénotype nul de type récessif peut résulter des trois mécanismes moléculaires suivants : 1) des mutations nucléotidiques ponctuelles affectant des sites d’épissage qui provoquent l’élimination de l’exon 6 (Jk ∆ 6) ou de l’exon 7 (Jk ∆ 7) et entraînent un changement de cadre de lecture avec l’apparition prématurée d’un codon stop. (Lucien et al. 1998; Yan et al. 2003). 2) une mutation nucléotidique faux-sens (T871C) introduisant la substitution Ser291Pro dans l’exon 9 et une perte d’adressage de la protéine à la membrane par rétention cytoplasmique observée dans le système d’expression hétérologue d’ovocytes de Xénope (Sidoux-Walter et al. 2000). 3) une mutation nucléotidique non-sens (C582T) affectant le codon Tyr194 dans l’exon 7 (Irshaid et al. 2002). Grâce au développement de tests de génotypage par PCR, la répartition au niveau mondial des mécanismes à la base du phénotype Jk nul a été examinée : la mutation Jk ∆ 6 a été localisée sur le pourtour de l’Océan Pacifique et la mutation Ser291Pro en Finlande. La mutation Jk ∆ 7 a été détectée en France chez un seul individu et la mutation Tyr194stop chez deux soeurs d’une famille Suisse (Irshaid et al. 2002). VII. Expression tissulaire du transporteur d’urée hUT-B1 Chez l’homme, les études en Northern blot montrent que les transcrits du transporteur d’urée hUT-B1 sont exprimés dans le foie fœtal humain, la prostate et la vessie sous forme de deux transcrits de 2 et 4,5 kb. Des transcrits de hUT-B1 sont également détectés dans d’autres organes : un signal faible de 4,5 kb est présent dans le cerveau et le thymus alors que dans le cœur, le muscle squelettique, le pancréas, le colon et l’intestin grêle, deux transcrits de 2 et 3,6 kb ont été mis en évidence. hUT-B1 s’exprime donc d’une manière ubiquitaire (Olivès et al. 1996). Des expériences d’immunohistochimie ont permis de localiser la protéine hUT-B1 dans différents organes comme la prostate, le rein, la vessie, la peau (Olivès, 1996 non publié). Au niveau du rein, la protéine hUT-B1 est exprimée dans les cellules endothéliales des vasa recta descendants de la medulla mais pas au niveau des cellules épithéliales des tubules rénaux (Xu et al. 1997). Ainsi par sa localisation, le polypeptide hUT-B1 est impliqué dans les échanges à contre-courant entre les vasa recta descendants et ascendants et contribue au maintien du gradient urée/sels à la base du mécanisme de concentration des urines (Figure 5). Parallèlement, des travaux chez le rat ont permis de mettre en évidence l’expression de la protéine UT-B1 dans le rein au niveau de la medulla rénale, dans les cellules gliales du cerveau, la vessie et les cellules de Sertoli des testicules mais pas dans le foie (Trinh-Trang-Tan et al. 2002). Les études de régulation de son expression dans le rein ont montré que le taux de protéine UT-B1 (à
