MINISTÈRE DE LA JEUNESSE DE L'ÉDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE
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Niveau: Supérieur
1 MINISTÈRE DE LA JEUNESSE, DE L'ÉDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ÉCOLE PRATIQUE DES HAUTES ÉTUDES Sciences de la vie et de la terre MÉMOIRE Présenté par Nelly DUBRULLE Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes Processus d'activation des calpaïnes ubiquitaires par le calcium : implication des domaines I et VI. Influence de la mélatonine et de dérivés acryliques. Soutenu le 31 mai 2011 à Montpellier devant le jury suivant : Monsieur le Pr. J-M. Exbrayat Président Monsieur le Dr. A. Ouali Rapporteur Monsieur le Dr. O. Coux Examinateur Monsieur le Pr. Y. Benyamin Tuteur pédagogique Madame le Dr. M-C. Lebart Tuteur scientifique Laboratoire EPHE de motilité cellulaire UMR 5235 (cc 107), place Eugène Bataillon 34095 Montpellier Cedex 05 Directeur du laboratoire et tuteur pédagogique : Dr Yves BENYAMIN (benyamin@univ- montp2.fr) Tutrice scientifique : Dr Marie-Christine LEBART ()
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1 MINISTÈRE DE LA JEUNESSE, DE L'ÉDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ÉCOLE PRATIQUE DES HAUTES ÉTUDES Sciences de la vie et de la terre MÉMOIRE Présenté par Nelly DUBRULLE Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes Processus d'activation des calpaïnes ubiquitaires par le calcium : implication des domaines I et VI. Influence de la mélatonine et de dérivés acryliques. Soutenu le 31 mai 2011 à Montpellier devant le jury suivant : Monsieur le Pr. J-M. Exbrayat Président Monsieur le Dr. A. Ouali Rapporteur Monsieur le Dr. O. Coux Examinateur Monsieur le Pr. Y. Benyamin Tuteur pédagogique Madame le Dr. M-C. Lebart Tuteur scientifique Laboratoire EPHE de motilité cellulaire UMR 5235 (cc 107), place Eugène Bataillon 34095 Montpellier Cedex 05 Directeur du laboratoire et tuteur pédagogique : Dr Yves BENYAMIN (benyamin@univ- montp2.fr) Tutrice scientifique : Dr Marie-Christine LEBART ()
- protéases acides
- maintien de l'homéostasie cellulaire
- calpaïnes
- succ-llvy-amc succinimide-llvy-amino
- protéine kinase
- indolyl-phosphate ?me
- cinnamic acid
- nacl chlorure de sodium nbt
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5MT ACA ADN AFM AIF Amp AMPc ARN BCA BCIP ME BSA CANP capn 1 et 2 CAST CP CP1B DFF DMEM DO DTT E64 EDC EDTA EGTA ELISA FAK FITC FPLC IAEDANS ICA IFN IFREMER IL INRA IPTG IUPs IκBαKana KCl Kd kDa Ki
LISTE DES ABRÉVIATIONS 5-methoxy tryptamine Amino cinnamic acid Acide désoxyribonucléique Association française contre les myopathies « Apoptose inducing factor » Ampicilline Adénosine monophosphate cyclique Acide ribonucléique Acide bicinchonique 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphateβmercapto éthanol « Bovine serum albumine » « Calcium activated neutral protéases » Gène des calpaïnes 1 et 2 Gène de la calpastatine Calpastatine « Calpastatin-derived calpain inhibitor 1B » « DNA fragmentation factor » « Dulbecco's modified eagle medium » Densité optique DithiothréitolTrans-epoxysuccinyl-L-leucylamido(4-guanidino)-butane1-ethyl-3-(3-(dimétylamino)-propyl)carbodiimideEthylene diamine tetra acetic acid Ethylene glycol tetra acetic acid « Enzyme linked immunosorbent assay » « Focal Adhesion Kinase » Isothiocyanate de fluorescéine « Fast prerformance liquid chromatography » N-iodoacétyl-N-(5-sulfo-1-naphtyl)ethylenediamineIodo cinnamic acid Interféron Institut français de recherche pour l'exploitation de la mer Interleukine Institut national de la recherche agronomique Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside « intrinsically unstructured proteins » « Inhibitory proteinκBα» Kanamycine Chlorure de potassium Constante d'affinité Kilo dalton Constante d'inhibition Longueur d'onde
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LGMD2A « Limb-Girdle Muscular Dystrophy type 2A » MDL28170 Carbobezoxy-valinyl-phenylalaninal ; calpain inhibitor III MgCl2 Chlorure de magnésium MM Masse moléculaire MT1, 2 et 3 Récepteur à la mélatonine 1, 2 et 3 NaCl Chlorure de sodium NBT Nitro blue tetrazolium NFκB « Nuclear factorκB » NHS N-hydroxysuccinimide oregon green 2'-7'-difluoresceine isothiocyanate PAGE « Polyacrylamide gel electrophoresis » PAL Phosphatase alcaline PBS « Phosphate buffer salin » PD 150606 3-(4-iodophenyl)-2-mercapto-(Z)-2-propenoic acid PD 151746 3-(5-fluoro-3-indolyl)-2-mercapto-(Z)-2-propenoic acid PMA Phorbol myristate acetate PFA Persulfate d'ammonium pHi Point isoelectrique PI Phosphatidylinositol PIP2Phosphatidylinositol 4,5 di-phosphate PKA Protéine kinase A PKC Protéine kinase C PKM Protéine kinase M PNP P-nitrophenyl PNPP P-nitrophenyl phosphate PP produit de pontage RMN Résonance magnétique nucléaire RPM Rotation par minute SDS Sodium dodecyl sulfate Si RNA « Small interfering ribonucleic acid » succ-LLVY-AMC Succinimide-LLVY-amino-4-coumarine TAE Tris acétate EDTA TEMED NNN'N'-tetramethylene diamine TIAA Trans indol acetic acid TNS Toluidinyl naphthalene sulfonate UA Unité arbitraire
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Sommaire
1.1.INTRODUCTIONGÉNÉRALE....................................................................................... 51.2.LES CALPAÏNES UBIQUITAIRES.................................................................................. 71.2.1.Introduction ....................................................................................................................... 71.2.2.Calpaïnes 1 et 2 ................................................................................................................. 71.2.3.Régulation : ..................................................................................................................... 121.2.4.Fonctions cellulaires ....................................................................................................... 151.2.5.Pathologies associées ...................................................................................................... 191.3.LES INHIBITEURS DES CALPAÏNES........................................................................... 211.3.1.22....................................................................................................................aplaC.enitats1.3.2. ............................................................................. 25Les inhibiteurs qui ciblent le site actif1.3.3.ne ciblent pas le site actif.................................................................. 27Les inhibiteurs qui 1.3.4.PD 150606 et PD 151746................................................................................................ 281.4.LA MÉLATONINE ET SES DÉRIVÉS............................................................................ 291.4.1.Synthèse de la mélatonine: .............................................................................................. 301.4.2.Sites d'action : ................................................................................................................. 301.4.3.Fonctions physiologiques : .............................................................................................. 311.4.4.entre la calpaïne et la mélatonine :.......................... 33Arguments invoquant une relation 1.4.5.Dérivés de la mélatonine :............................................................................................... 34
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INTRODUCTION
1.1. Introduction Générale Les tissus se renouvellent et compensent les pertes cellulaires (apoptose) tout au long de la vie en harmonie avec un environnement qui évolue. Pour conserver leur homéostasie (stabilité des paramètres physico-chimiques), les cellules utilisent deux processus importants : lanabolisme et le catabolisme. Le premier est une activité de synthèse alors que le second détruit les édifices moléculaires. Les protéines essentielles au fonctionnement cellulaire et à la croissance sont synthétisées en permanence mais ont une durée de vie très variable. Cest un mécanisme qui requiert de l'énergie. Leur dégradation qui par ailleurs libère de lénergie, est la source principale en acides aminés réaffectés à la synthèse de nouvelles protéines. Lensemble de cet équilibre cellulaire définit une partie du métabolisme cellulaire. Les protéases sont les catalyseurs (enzymes) qui dégradent les protéines par hydrolyse de leurs liaisons peptidiques. Il existe quatre groupes majeurs de protéases (Rawlings et al., 2004) : les protéases acides présentant une triade à acide aspartique et qui agissent à pH acide (ex : la pepsine) ; les métalloprotéases, qui possèdent un cation métallique qui intervient directement dans la protéolyse (ex : la thermolysine) ; triade à serine (site actif) qui permet l'attaqueles protéases à serines, présentant une nucléophile (ex : la trypsine et la chymotrypsine) ; la cystéine du site actif permet l'attaque nucléophileles protéases à cystéines, dont (ex : les caspases et les calpaïnes). Deux autres types de protéases ont été découverts : les protéases à thréonines (Wilkin et al., 1994) et les protéases à acides glutamiques (Sims et al., 2004). Enfin, le protéasome (20s et 27s) qui intègre plusieurs sites de catalyse et un système dadressage basé sur lubiquitine et diverses chaperonines, est assimilable à un organite cellulaire. La protéolyse permet l'élimination de protéines mal conformées ou anormales (protéines mutées, protéines virales), la digestion de structures phagocytées (bactéries, mitochondries) ou lactivation de précurseurs hormonaux ou enzymatiques, ainsi que le maintien de l'homéostasie cellulaire. Elle confère aussi un caractère irréversible à certains
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processus biologiques (cycle cellulaire, apoptose, ...). Il est évident que les perturbations de ces mécanismes aboutissent à une létalité cellulaire ou à des pathologies lourdes souvent dorigine génétique. Nous nous sommes intéressée plus particulièrement aux calpaïnes du fait de leur forte implication dans la régulation du cytosquelette et la motilité cellulaire (axe de recherche du laboratoire), dans les conséquences délétères de lischémie sur lintégrité des tissus musculaires (collaboration avec l'AFM, lINRA et lIFREMER) et leur sur-activation dans les processus apoptotiques affectant les tissus nerveux (maladies neurodégénératives). Le système protéolytique des calpaïnes est étudié depuis plusieurs décénies (Guroff et al., 1964 ; Dayton et al., 1976) ; cependant, il reste plusieurs questions non résolues, essentielles, portant sur leur mécanisme dactivation dans un contexte cellulaire. Notre travail s’est orienté ainsi vers la recherche d’inhibiteurs spécifiques susceptibles de respecter leurs fonctions de protéases indispensables à la viabilité cellulaire, donc d'activité inhibitrice modérée, mais capables de bloquer ou de limiter fortement leur sur-activation lorsque l’homéostasie calcique intracellulaire est menacée. Notre intérêt s'est porté sur des molécules dérivées de la mélatonine de par leurs similitudes de structure avec des inhibiteurs puissants déjà existants.
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1.2. Les calpaïnes ubiquitaires 1.2.1. Introduction Découvertes en 1964 par Guroff, les calpaïnes sont des protéases cytosoliques régulées par les ions divalents Ca2+ calcium; elles sont dites « dependantes ». Elles font partie de la famille des protéases à cystéines qui comprend, entre autres, les caspases, les calpaïnes et les papaïnes. Elles sont aussi appelées CANP (« calcium activated neutral protéases »). Ces protéines présentes dans toutes les cellules eucaryotes (unicellulaires, levures, végétaux, animaux) sont ubiquitaires (présentes dans tous les tissus) et apparentées à des protéines bactériennes (Berti et Storer, 1995). Il existe plusieurs types de calpaïnes (pour revue, cf. Goll et al., 2003) : chez lhomme quatorze isoformes ont été recensées à ce jour (Wu et al., 2007). Nous nous sommes intéressée aux deux isoformes ubiquitaires : la calpaïne 1 (ou-calpaïne) et la calpaïne 2 (ou m-calpaïne) qui se différencient par la concentration en calcium (Ca2+) nécessaire à leur activationin vitro (concentrations respectivement de lordre du micromolaire 1 à 10 µM- et du millimolaire 0,2 à 0,5 mM-) (Croall et al., 1994). Ce sont les isoformes les plus représentées dans la cellule, et elles présentent entre elles 55 à 65% dhomologie de séquence. 1.2.2. Calpaïnes 1 et 2 Les calpaïnes 1 et 2 sont des hétérodimères constitués de deux sous-unités. Elles sont codées par des gènes différents sur le chromosome 19 chez lhomme, par exemple, la-calpaïne (ou calpaïne 1) est codée par le gène 11 (capn1), et la m-calpaïne (ou calpaïne 2) est codée par le gène 1 (capn2) (Aoki et al., 1986 ; Sorimachi et al., 1990). La sous-unité catalytique (grande sous-unité, 80 kDa) est constituée de quatre domaines (DI à DIV), elle contient la triade catalytique (domaine DII) et six sites de fixation du calcium, dont 4 dans le domaine DIV, organisés en motifs « EF hands » (cf. effet du calcium et « EF hand », p 5) et deux non « EF-hand » dans le domaine DII. La petite sous-unité (30 kDa), ou sous-unité régulatrice, est commune aux deux calpaïnes et présente quatre motifs « EF-hand » susceptibles de fixer les ions Ca2+. Un cinquième motif de ce type présent dans les domaines IV et VI nest pas fonctionnel vis-à-vis du calcium (figure n°1). Les calpaïnes sont reparties en deux classes : les typiques et les atypiques selon la présence ou non, sur la sous-unité catalytique, dun domaine C-terminal liant les ions Ca2+par des motifs de type EF-hand (pour revue, Goll et al., 2003).
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Structure : La structure en domaines a été initialement déterminée par analyse de la séquence des calpaïnes 1 et 2 (Ohno et al., 1984) puis confirmée par la cristallographique (Hosfields et al., 1999 ; Strobl et al., 2000 ; Hanna et al., 2008 ; Moldoveanu et al., 2008) de la calpaïne 2 (figure n°2). A ce jour, la structure 3D de la calpaïne 1 est inconnue. La grande sous-unitéou sous-unité catalytique est constituée de quatre domaines : - Le domaine I correspond à la séquence N-terminale : environ vingt résidus. Il sorganise en une hélice, qui interagit avec le domaine VI de la sous-unité régulatrice en absence de calcium. En présence de calcium (activation de la calpaïne 2), il se sépare du domaine VI puis est rapidement clivé (autolyse des calpaïnes 1 et 2). - en absence de calcium, il se divise en 2 ;Le domaine II est le domaine catalytique sous-domaines IIa et IIb. La fixation du calcium, et les modifications conformationnelles qui en découlent vont rapprocher ces deux domaines pour organiser le site actif (Moldoveanu et al., 2002). La triade ainsi créée se compose pour la calpaïne 1 dune cystéine en position 115 sur le domaine IIa, dun résidu histidine en position 272 et dun résidu asparagine en position 296 sur le domaine IIb. Pour la calpaïne 2 ces résidus se situent en position 105 (Cys), 262 (His) et 286 (Asp) (Hata et al., 2001). Le sous-domaine IIa est relié au domaine DVI par lintermédiaire du domaine I. Le sous domaine IIb interagit directement avec le domaine III. - la fixation de phospholipides (Tompa et al., 2001 ;Le domaine III est impliqué dans Shao et al., 2006). Il est constitué de huit feuillets Il possède une antiparallèles. boucle hautement acide tournée vers lextérieur de la protéine en contact avec le sous-domaine IIb. C'est un domaine en interaction avec tous les autres domaines (Hosfield et al., 1999). Bien que son rôle ne soit pas encore parfaitement délimité, il a une implication importante dans les changements conformationnels qui accompagnent lactivation des calpaïnes (Tompa et al., 2001 ; Hanna et al., 2008). Ce domaine contient plusieurs sites de phosphorylations impliqués dans la régulation des calpaïnes (Shiraha et al., 2002). Totalement instable à létat isolé, il conduit la transformation de la calpaïne 2 en présence de calcium, dune situation de proenzyme inactive à lenzyme activée (Hanna et al., 2008 ; Moldoveanu et al., 2008).
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- Le domaine IV présente une homologie de séquence avec la calmoduline (22 à 44% didentité). Ce domaine se compose de cinq motifs de type « EF-Hand » dont un est inactif vis-à-vis des ions Ca2+. Les domaines « sont connus comme EF-Hand » susceptibles de favoriser la dimérisation des protéines qui les supportent (Huang et al., 2009). Dans le cas de la calpaïne, le cinquième site de fixation est impliqué dans lhétéro-dimérisation avec son homologue du domaine DVI (Todd et al., 2003 ; Hanna et al., 2008). La structure 3D obtenue par cristallographie montre que le domaine IV et le domaine VI (petite sous-unité) possèdent une structure secondaire et une structure tertiaire similaire composée de huit hélices. La petite sous-unité (sous-unité régulatrice), commune aux calpaïnes 1 et 2, est composée des domaines V et VI : - Le domaine V : c'est le domaine NH2de la sous-unité régulatrice ; il est trèsterminal hydrophobe du fait de sa composition riche en glycines (40 résidus glycine sur les 64 premiers résidus). Il sécarte de la protéine du fait de la présence dune séquence hydrophile porteuse de plusieurs prolines consécutives. Cest en fait une ancre hydrophobe destinée à positionner les calpaïnes 1 et 2 sur les membranes. Ce domaine est autolysé lors de l'activation des calpaïnes, ce qui libère des membranes lenzyme active. - ressemble au domaine IV, il possède : initialement appelé IV car il Le domaine VI cinq motifs « EF-hand » dont quatre susceptibles de fixer les ions Ca2+. Après activation, il resterait lié à la sous-unité catalytique grâce à son domaine EF5, mais cet aspect est assez contesté et la dissociation des deux sous-unités après activation et autolyse est soutenue par les résultats de plusieurs équipes (Li et al., 2004 ; Pal et al., 2001 ; Yoshiawa et al., 1995).
Effets du calcium et motifs « EF-hand » : Les motifs « EF-hand » ont été définis pour la première fois par Kretsinger en 1975. Ce sont des motifs denviron quarante résidus dont la structure sorganise en « hélice-boucle-hélice », motifs retrouvés dans une large famille de protéines liant le calcium. Ils se composent de deux hélicespratiquement perpendiculaires liées par une boucle (en général
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douze acides aminés) qui peut lier un ion Ca2+(figure n°3). Celui-ci se positionne dans une configuration pentagonale au niveau dun acide aminé glutamate ou acide aspartique lors de la liaison. La chélation du calcium se traduit par une augmentation de lhydrophobicité de la structure liante et des modifications conformationnelles locales. La calmoduline est une protéine capable de lier quatre ions calcium par lintermédiaire de sa structure tetra « EF-hand ». Cest une protéine possédant une forte homologie de séquence avec les domaines IV et VI des calpaïnes. Les calpaïnes présentent cinq motifs EF-hand, sur les domaines IV et VI. Elles appartiennent à la famille des protéines penta EF-hand (ex : sorcine et grancalcine) (Nakamaya et Kretsinger, 1994). La structure 3D obtenue par cristallographie en présence de 5 mM CaCl2 et al., 2008) montre que quatre ions (Hanna calcium sont liés sur le domaine IV ainsi que sur le domaine VI. A des concentrations de calcium sub-millimolaire, trois motifs « EF-hand » par domaine sont saturés. Le cinquième motif qui ne fixe pas de calcium entre en jeu dans lhétérodimèrisation des domaines IV et VI (Hanna et al., 2008 ; Moldoveanu et al., 2008). La concentration en calcium nécessaire à lactivité des calpaïnes est différente selon quil sagit de la calpaïne 1 ou 2. La calpaïne 1 est activée entre 2 et 50 µM de calcium alors que la calpaïne 2 est activée par 250 à 1000 µM de calcium. De plus, laffinité des ions Ca2+vis-à-vis des motifs « EF-hand » varie en fonction de chaque domaine (Suzuki et al., 1987). Une synergie affectant leur affinité, comme celle démontrée pour la calmoduline, nest pas exclue(Yangetal.,2003;Georgeetal.,1996).LaprésencedecalciumsurlesdomainesIVet VI augmente les capacités d'interaction de ces protéases. Les données structurales obtenues à partir de la calpaïne 2 cristallisée en absence et en présence de calcium (figure n°4) montrent que lorsquelle est inactive (absence de calcium), lextrémité du domaine I est ancrée et visible dans le domaine VI (Hosfield et al., 1999; Moldoveanu et al., 2008; Hanna et al., 2008). Au cours de lactivation de la protéase par le calcium, dimportants changements conformationnels se produisent, entraînant un basculement du domaine III et une compaction importante de la protéine qui rapprocherait le domaine IIa du domaine IIb pour former le site catalytique. En effet, à létat inactif la cystéine 105 et lhistidine 262 sont séparées par une distance de 10,5 Å alors qu'à létat actif elles ne sont plus séparées que par 3,7 Å (Hosfield et al., 1999 ; Hanna et al., 2008). De plus, le domaine I devient invisible, ce qui traduit une plus grande mobilité. En se libérant du domaine VI, il permettrait le déplacement du sous-domaine IIa vers le sous-domaine IIb (Hanna et al., 2008).
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Localisation : Les calpaïnes sont intracellulaires (Goll et al., 1992 ; Kumamoto et al.,1992 ) et leur activité varie en fonction des processus cellulaires endogènes. Les isoformes et les quantités exprimées varient aussi selon les tissus et les étapes de différenciation lors de lembryogenèse (Raynaud et al., 2008). Leur localisation a beaucoup été étudiée, et bien que les calpaïnes 1 et 2 soient dites ubiquitaires, la calpaïne 2 n'est pas présente dans les plaquettes et les érythrocytes de porc, et la calpaïne 1 n'est pas présente dans les plaquettes de boeuf (Goll et al., 2003). La technique d'immunofluorescence a montré une localisation uniquement intracellulaire de ces protéases (Gil-Parrado et al., 2003 ; Lane et al.,1992 ). La microscopie électronique a permis de préciser leurs zones de concentration (Borjin et al., 2006 ; Yoshimura et al., 1986). Il a été démontré que dans des cellules non stimulées, les sous-unités régulatrices et catalytiques endogènes associées ou exogènes se répartissent uniformément dans le cytoplasme (Gil-Parrado et al., 2003). Cependant, des études fréquentes suggèrent quune importante proportion des calpaïnes nest pas libre dans le cytoplasme mais associée à des structures subcellulaires comme les membranes, le réticulum endoplasmique et lappareil de Golgi (Hodd et al., 2006). Elles pourraient aussi être en interaction avec le cytosquelette (Raynaud et al., 2005) bien que la plupart des études montrent une distribution cytosolique plutôt quune association avec une organelle particulière. Il est vraisemblable que les interactions organelles-calpaïnes sont faibles (Kd de lordre du micromolaire) et quune dynamique déchange entre le cytosquelette et les structures cellulaires sétablit. En présence de concentration calcique supérieure à 100 nM, il a été démontré que laffinité des calpaïnes pour des structures porteuses pourrait croître (Coulis et al., 2008). Cependant, il semblerait que la calpaïne 2 interagisse plus spécifiquement avec les membranes par lintermédiaire des radeaux lipidiques (Hood et al., 2006). Dautres travaux démontrent une localisation nucléaire de la calpaïne 2 (Raynaud et al., 2004) : en effet, des études réalisées sur des cellules musculaires montrent que pendant leur prolifération (embryogenèse, régénération), les calpaïnes se situent dans les noyaux sur les chromosomes alors quune fois la différenciation en myotubes achevée, la répartition de cette protéase est cytosolique (Raynaud et al., 2004). Cette localisation cellulaire indique une implication de la calpaïne 2 dans la régulation du cycle cellulaire et plus spécifiquement lors de la condensation des chromosomes (pro métaphase) (Magnaghi-jaulin et al., 2010). A lopposé, la calpaïne 1 a plutôt été localisée en interaction avec le cytosquelette (Raynaud et al., 2006 ; Raynaud et al., 2005 ; Lebart & Benyamin, 2006).
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