MINISTÈRE DE LA JEUNESSE DE L'ÉDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE
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2006
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Niveau: Supérieur
MINISTÈRE DE LA JEUNESSE, DE L'ÉDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ÉCOLE PRATIQUE DES HAUTES ÉTUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE Présenté par Séverine Lecourt Pour l'obtention du diplôme de l'École Pratique des Hautes Études CARACTÉRISATION PHÉNOTYPIQUE, CAPACITÉS DE DIFFÉRENCIATION ET CAPACITÉS IMMUNOSUPPRESSIVES DES CELLULES SOUCHES MÉSENCHYMATEUSES (SAINES OU PATHOLOGIQUES) ET MUSCULAIRES Soutenu le 13 novembre 2006 devant le jury suivant : Président du jury : Dr. Bruno Canque Rapporteur : Dr. Jean-Luc Vayssière, Dr. Pierre Marie Examinateurs : Dr. Jean-Thomas Vilquin, Pr. Jean-Pierre Marolleau, Dr. Sophie Le Ricousse Directeur EPHE : Dr Jean-Luc Vayssière () Laboratoire de Génétique Moléculaire et Physiologique de l'EPHE Université de Versailles/St Quentin Bâtiment Fermat 45, av des Etats-Unis-78035 Versailles Cedex. Directeur de stage : Dr Jean-Thomas Vilquin () Laboratoire de Physiologie et Thérapie du Muscle Strié du Dr Pascale Guicheney Institut de Myologie / unité Inserm 582, 47 Bd de l'Hôpital, 75651 Paris cedex 13 RESUME La greffe de cellules ou d'organes est une solution envisageable dans certaines situations lorsqu'une fonction est gravement altérée.
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MINISTÈRE DE LA JEUNESSE, DE L'ÉDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ÉCOLE PRATIQUE DES HAUTES ÉTUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE Présenté par Séverine Lecourt Pour l'obtention du diplôme de l'École Pratique des Hautes Études CARACTÉRISATION PHÉNOTYPIQUE, CAPACITÉS DE DIFFÉRENCIATION ET CAPACITÉS IMMUNOSUPPRESSIVES DES CELLULES SOUCHES MÉSENCHYMATEUSES (SAINES OU PATHOLOGIQUES) ET MUSCULAIRES Soutenu le 13 novembre 2006 devant le jury suivant : Président du jury : Dr. Bruno Canque Rapporteur : Dr. Jean-Luc Vayssière, Dr. Pierre Marie Examinateurs : Dr. Jean-Thomas Vilquin, Pr. Jean-Pierre Marolleau, Dr. Sophie Le Ricousse Directeur EPHE : Dr Jean-Luc Vayssière () Laboratoire de Génétique Moléculaire et Physiologique de l'EPHE Université de Versailles/St Quentin Bâtiment Fermat 45, av des Etats-Unis-78035 Versailles Cedex. Directeur de stage : Dr Jean-Thomas Vilquin () Laboratoire de Physiologie et Thérapie du Muscle Strié du Dr Pascale Guicheney Institut de Myologie / unité Inserm 582, 47 Bd de l'Hôpital, 75651 Paris cedex 13 RESUME La greffe de cellules ou d'organes est une solution envisageable dans certaines situations lorsqu'une fonction est gravement altérée.
- tissu musculaire
- différenciation ostéogénique
- capacité
- muscle
- altérations des capacités
- mésenchymateuses
- csm
- cellule souche
- csm médullaires
- caractérisation phénotypique
MINISTÈRE DE LA JEUNESSE, DE LÉDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ÉCOLE PRATIQUE DES HAUTES ÉTUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE Présenté par Séverine Lecourt Pour lobtention du diplôme de lÉcole Pratique des Hautes Études CARACTÉRISATION PHÉNOTYPIQUE, CAPACITÉS DE DIFFÉRENCIATION ET CAPACITÉS IMMUNOSUPPRESSIVES DES CELLULES SOUCHES MÉSENCHYMATEUSES (SAINES OU PATHOLOGIQUES) ET MUSCULAIRES
Soutenu le 13 novembre 2006 devant le jury suivant : Président du jury : Dr. Bruno Canque Rapporteur : Dr. Jean-Luc Vayssière, Dr. Pierre Marie Examinateurs : Dr. Jean-Thomas Vilquin, Pr. Jean-Pierre Marolleau, Dr. Sophie Le Ricousse Directeur EPHE : Dr Jean-Luc Vayssière (vayssiere@genetique.uvsq.fr) Laboratoire de Génétique Moléculaire et Physiologique de lEPHE Université de Versailles/St Quentin Bâtiment Fermat 45, av des Etats-Unis-78035 Versailles Cedex. Directeur de stage : Dr Jean-Thomas Vilquin (jt.vilquin@myologie.chups.jussieu.fr) Laboratoire de Physiologie et Thérapie du Muscle Strié du Dr Pascale Guicheney Institut de Myologie / unité Inserm 582, 47 Bd de lHôpital, 75651 Paris cedex 13 RESUME La greffe de cellules ou d’organes est une solution envisageable dans certaines situations lorsqu’une fonction est gravement altérée. Les cellules souches sont des composantes essentielles de la régénération des tissus. Ces transplantations sont cependant limitées par la pénurie de donneurs et les problèmes immunologiques de rejet. Par ailleurs, l’utilisation des cellules souches embryonnaires est limitée (pour des problèmes éthiques, de production et d’éventuel rejet). La réparation d’organes et de tissus par des cellules
souches autologues pourrait fournir une solution alternative, c’est pourquoi nous nous sommes tournés vers l’utilisation de cellules souches adultes. Le caractère multipotentiel et le pouvoir immunomodulateur des cellules souches mésenchymateuses (CSM) médullaires en font des candidats reconnues pour la thérapie cellulaire à visée réparatrice et pour des interventions immunomodulatrices. Leur obtention nécessite cependant une ponction de moelle osseuse. Le tissu musculaire est extrêmement volumineux et serait d’accès plus aisé. Les cellules souches issues du muscle possèdent-elles les mêmes caractéristiques que les CSM ? Dans certains contextes pathologiques tels que le myélome multiple, les CSM ont-elles des altérations fonctionnelles intrinsèques ou secondaires à une stimulation par les plasmocytes tumoraux ? Nos travaux montrent que les cellules souches issues du muscle squelettique ont des caractéristiques communes avec les CSM médullaires. Tout d’abord sur le plan phénotypique, elles expriment les mêmes marqueurs. Au point de vue des capacités de différenciation, les cellules souches issues du muscle ne se comportent pas de la même manière : la fraction CD56+/CD15- (myoblastes) est capable de suivre les voies de l’ostéogenèse, de la chondrogenèse et de la myogenèsein vitro. En revanche, la fraction CD56-/CD15+, qui est non myogénique est capable de suivre la voie de l’adipogenèse en plus des voies de l’ostéogenèse et de la chondrogenèse. Aussi, nous avons pu observer que les cellules souches issues du muscle possèdent des capacités immunomodulatrices. Cependant, l’immunomodulation est moins efficace que celle obtenue avec les CSM médullaires. Les mécanismes impliqués dans ce phénomène sont en cours d’étude dans notre laboratoire. Nos études sur les CSM issues de patients atteints de myélome multiple ont montré des capacités de différenciation en adipocytes et ostéoblastes comparables à celles des CSM saines. Nous avons cependant observé des altérations des capacités immunosuppressives ainsi qu’une surproduction de l’Il-6 n’étant pas la conséquence d’une stimulation par les plasmocytes myélomateux. En conclusion, il existe plusieurs populations de cellules pluripotentes dans le tissu musculaire humain ayant des capacités de différenciation similaires aux CSM mésenchymateuses et des capacités immunosuppressives. Ces cellules pourraient représenter de bonnes candidates dans des perspectives cliniques. Par contre, les CSM médullaires de patients atteints de myélome multiple présentent certaines fonctions altérées telles que l’immunomodulation et la sécrétion d’Il-6. MOTS-CLES Cellules souches mésenchymateuses, cellules souches musculaires, phénotype, différenciation, myogenèse, adipogenèse, ostéogenèse, chondrogenèse, immunosuppression, myélome multiple.
SOMMAIRE
LISTE DES ABBREVIATIONS p1 AVANT PROPOS p3 INTRODUCTION p4
1. Le tissu musculaire p4
1.1. Définition p4 1.2. Caractéristiquesp4 1.3. Myogenèse p4 1.3.1. p4Origine du tissu musculaire 1.3.2. Myogenèse primaire p5 1.3.3. p6Myogenèse secondaire 1.4. Structure du tissu musculaire strié squelettique p6 1.4.1. p6Composante musculaire 1.4.2. p7Composante conjonctive 1.4.3. Vascularisation p7 1.4.4. Innervation p7 1.5. Régénération du muscle squelettiquep8 1.6. Immunobiologie du musclep8 1.6.1. p9Expression de molécules HLA 1.6.2. Processing et présentation de l’antigène p9 1.6.3. Expression de récepteurs membranaires p10 1.6.4. Synthèse de facteurs solubles p11 1.7. Pathologies du muscle striép11 1.7.1. Myopathies d’origine génétiques p11 1.7.2. Myopathies acquises p12
2. La moelle osseuse p12
2.1. Structure de la moelle osseusep12 2.1.1. p12Cadre osseux 2.1.2. Vascularisation p13 2.1.3. p13Cellules hématopoïétiques 2.1.4. p13Microenvironnement médullaire 2.2. Niche hématopoïétique : mécanismes moléculairesp14 2.3. Pathologiesp14 2.3.1. Syndromes myéloprolifératifs p14 2.3.2. Syndromes lymphoprolifératifs p15 3. Muscle, moelle osseuse et cellules souches p15
3.1. Cellules souches : définition, classificationp15 3.2. Les cellules souches du tissu musculairep16 3.2.1. cellules à potentiel myogénique : cellules satellites et cellules SP p16 3.2.2. cellules à potentiel non-myogénique p18 3.3. Les cellules souches mésenchymateusesp19 3.3.1. p19Capacités de prolifération élevées 3.3.2. Marqueurs phénotypiques des CSM humaines p19 3.3.3. p20Différenciation des CSM 3.3.4. pouvoir immunomodulateur des CSM médullaires p22 3.3.4.1. in vitro : inhibition de la réaction mixte lymphocytaire p22 3.3.4.2. in vivo : amélioration de la prise de greffe p24 3.4. Utilisation clinique des cellules souchesp24 3.4.1. p24Thérapie cellulaire et CSM 3.4.2. p24Thérapie cellulaire et myoblastes
Culture et expansion des CSM médullaires p29 Culture et expansion des cellules musculaires p29 Sélection immunomagnétique des cellules musculairesp30 Phénotypage par cytométrie en fluxp30 Différenciation myogéniquep30 Marquage de la myosine par immunofluorescence p30 Différenciation adipogéniquep31 Différenciation ostéogénique, mise en évidence de l’activité enzymatique de la phosphatase alcaline (ALP) et de la calcification (coloration alizarine) p31 Transcription inversep32 PCR classiques sur les gènes de l’ostéogenèsep32 Réaction Mixte Lymphocytaire (MLR : Reaction Mixed Lymphocyte)p33 Réaction Mixte Lymphocytaire en présence d’anticorps bloquant contre la protéine Xp33 Marquage FACS intracellulaire de la protéine Xp33 Dosage du PGE2 par ELISA p34 PREMIERE PARTIE : Etude des cellules souches musculaires : Caractérisation phénotypique, potentiels de différenciation et capacités immunosuppressives p35 1. Sélections magnétiques des fractions musculaires d’intérêt p35
2. Phénotypage des populations musculaires comparées aux CSM médullaires p36 3. Différenciation des cellules souches musculaires en comparaison aux CSM médullaires p40 3.1. Différenciation myogéniquep40 3.2. Différenciation adipogéniquep41 3.3. Différenciation ostéogéniquep42 4. Capacités immunomodulatrices des CSMs médullaires et des cellules souches musculaires p46 4.1. Inhibition de la MLRp46 4.2. Synthèse de prostaglandine E2p47 4.3. Expression de la protéine Xp48 4.4. Diminution de l’inhibition de la MLR par un anticorps bloquant la protéine Xp49 DEUXIEME PARTIE : Etude des CSM de patients atteints de myélome multiple : potentiels de différenciation et capacités immunosuppressives.P51 6. Différenciation des CSM MM en comparaison aux CSM médullairesp51 6.1. Différenciation adipogéniquep51 6.2. Différenciation ostéogéniquep51 7. Capacités immunomodulatrices des CSM MM p52 Inhibition de la MLRp5 2 DISCUSSION p54 CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES p65 BIBLIOGRAPHIE p67 ANNEXE Article accepté dans Leukemia : Phenotypic and functional characterization of bone marrow mesenchymal stem cells derived from patients with multiple myeloma.
LISTE DES ABBREVIATIONS
ADAS: Adipose-tissue Derived Adult Stem Cells ADN: acide désoxyribonucléique ALCAM: Activated Leukocyte Cell Adhesion Molecule ALP: Alkaline Phosphatase APC: Allophycocyanin ARN: acide ribonucléique : Adénosine Tri-Phosphate ATP bFGF: basic Fibroblast Growth Factor BMP: Bone Morphogenic Protein CAM: Cell Adhesion Molecule Cellule ES: cellule souche embryonnaire Cellules SP: cellules de la « Side Population » CFU-F: Colony Forming Unit Fibroblast C: complexe majeur d’histocompatibilité MH CPA: cellule présentatrice de l’antigène CSH: Cellule Souche Hématopoïétique CSM: Cellule Souche Mésenchymateuse DMEM: Dubelcco’s Modified Eagle’s Medium DMFSH: dystrophie musculaire facio-scapulo-humérale DMOP: dystrophie musculaire oculopharyngée DMSO: Dimethyl Sulfoxide ELISA: Enzyme Linked Immunosorbent Assay FACS: luorescent Activated Cell Sorter : cytométrie en flux F FITC: Fluorescein Isothiocyanate GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase G-CSF: Granulocyte Colony Stimulating Factor GM-CSF: Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor GVHDDisease : réaction du greffon contre l’hôte: Graft Versus Host HGF: Hepatocyte Growth Factor HLA: Human Leukocyte Antigen ICAM: Intercellular Cell Adhesion Molecule ICOS / ICOS-L: Inducible Co-Stimulator Ligand IDO: indoleamine 2,3-dioxygenase IGF:Insulin Growrh Factor IFN-g : Interferon gamma Il: interleukine LFA-1: Leukocyte Function Associated-1 Antigen LIF: Leukemia Inhibitory Factor MAPC: Multipotent Adult Progenitor Cell M-CSF: Macrophage Colony Stimulating Factor
MLR: mixed lymphocyte reaction : réaction mixte lymphocytaire MM: myélome Multiple MMP: Matrix Metaloproteinase MRF: Myogenic Regulating Factors Myf-5: Myogenic factor 5 MyoD: Myogenic differentiation Pax-3 / Pax-7: Paired box gene 3 / 7 PBMC: Peripheral Blood Mononuclear Cell : cellules mononuclées du sang périphérique PBS: Phosphate Buffered Saline PDGF: Platelet Derived Growth Factor PE: Phycoerythrin PGE2: Prostaglandine E2 PPAR-g : Peroxisome Proliferator Activated Receptor Gamma PPSC: Pluripotent Stem Cell rhHGF :recombinant human Hepatocyte Growth Factor RT-PCR: Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction SVF: Sérum de Veau Fœtal TGF-b:Transforming Growth Factor beta TNF-a : Tumor Necrosis Factor alpha VEGF: Vascular endothelial Growth Factor
INTRODUCTION
1. Le tissu musculaire : 1.1. Définition Le terme de cellule musculaire recouvre l’ensemble des cellules douées de propriétés contractiles et regroupées au sein de structure organisées, les muscles. Il existe trois types de tissus musculaires : - volontaires sous contrôle duLe tissu musculaire strié squelettique qui permet les mouvements système nerveux cérébro-spinal. - Le tissu musculaire lisse qui permet les mouvements non-volontaires sous le contrôle du système nerveux végétatif. - muscle duLe tissu musculaire strié myocardique qui permet la contraction non-volontaire cardiaque sous contrôle du système nerveux végétatif. 1.2. Caractéristiques
Quel que soit leur tissu d’appartenance, les fibres musculaires possèdent les caractéristiques suivantes : - le cytoplasme des cellules musculaires contient deux types de protéines filamentaires contractiles : les myofilaments d’actine et les myofilaments de myosine. - contient de nombreux récepteurs et transporteurs, notamment desLa membrane plasmique transporteurs de glucose. - Les cellules musculaires sont revêtues par une membrane basale. - myofilaments d’actine des cellules musculaires sont ancrés à la laminine de la membraneLes basale par un complexe protéique transmembranaire.
1.3. La myogenèse 1.3.1. Origine du tissu musculaire Dans l’embryogenèse des vertébrés, le tissu musculaire squelettique se forme à partir du mésoderme qui se segmente d’une part en somites et d’autre part en notochorde. La partie ventrale des somites, le sclérotome contribue à la formation du cartilage et des os de la colonne vertébrale et des côtes. La partie dorsale des somites, le dermomyotome, donne naissance au derme dorsal et aux muscles squelettiques du dos et des membres. La délamination et la migration de cellules provenant du dermomyotome donne naissance au myotome à l’origine de la musculature du tronc(Buckingham, Bajard et al. 2003). Cette organisation dorso-ventrale du somite (dermomyotome/myotome/sclérotome) est sous l’influence de plusieurs protéines dont celles de la famille Wnt (Wingless) et la protéine Shh (Sonic hedgehog). Une hypothèse consiste à considérer une balance entre leur niveau d’activité, formant un gradient depuis leur site de sécrétion, ce qui déterminerait la formation des différents compartiments du somite (Tajbakhsh, Borello et al. 1998). 1.3.2. Myogenèse primaire La myogenèse primaire se caractérise par la formation de fibres musculaires primaires à partir des myoblastes embryonnaires. Ces derniers fusionnent pour former les myotubes de première génération ou myotubes primaires principalement à l’origine des fibres lentes, mais aussi des fibres rapides dans les muscles entièrement rapides (Stockdale and Miller 1987). Au final, ces fibres ne représentent qu’une petite partie du muscle adulte. Les cellules précurseurs se délaminent des somites et migrent vers leur lieu de différenciation sous l’influence de différentes protéines comme par exemple le facteur de transcription Pax3 (paired box gene 3). La détermination et la différenciation des cellules participant à la formation du muscle sont sous l’influence de facteurs environnementaux induisant l’expression de facteurs de transcription spécifiques de ce lignage : les MRF (Myogenic Regulating Factors). Les MRF sont au nombre de quatre chez les mammifères : Myf5 (Myogenic factor 5), MyoD (Myogenic differentiation),
Myogénine, et MRF4. Myf5 et MyoD sont impliqués dans les phases précoces de la myogenèse lors de la détermination et de la prolifération de la lignée myoblastique. Ils interviennent également dans la régulation du cycle cellulaire, le remodelage de la chromatine et l’activation de gènes musculaires précoces. Les gènes codant pour MRF4 et la myogénine sont des gènes de la différenciation myogénique, ils agissent plus en aval dans la différenciation terminale des myocytes et leur fusion en myotubes. La surexpression de l’un des quatre MRF dans des cellules non musculaires entraîne l’activation d’un programme de différenciation myogénique alors que des souris invalidées génétiquement pour les MRF précoces ne forment pas de musculature squelettique (Rudnicki, Schnegelsberg et al. 1993). 1.3.3. Myogenèse secondaire Au cours de la myogenèse secondaire, la croissance de la masse musculaire est plus importante et l’innervation des muscles commence. L'innervation est indispensable au maintien de la génération primaire et à la mise en place de la génération secondaire. Celle-ci résulte de l'activité des myoblastes secondaires (ou myoblastes foetaux) qui sont présents autour des fibres primaires innervées et vont se multiplier puis fusionner en donnant des fibres secondaires, exprimant des isoformes de chaînes lourdes de myosine différentes de la génération précédente. Les myotubes secondaires sont à l’origine des fibres rapides en majorité, mais également des fibres lentes dans les muscles entièrement lents ou mixtes (Stockdale and Miller 1987). 1.4. Structure du tissu musculaire strié Le tissu musculaire strié auquel nous nous sommes intéressés au cours de cette étude comprend quatre composantes : musculaire, conjonctive, vasculaire et nerveuse. 1.4.1. Composante musculaire : Le corps du muscle strié est relié au squelette par les tendons. Il est formé de faisceaux de fibres musculaires. Chaque fibre musculaire, aussi appelé rhabdomyocyte, contient dans son cytoplasme des myofibrilles. Chaque myofibrille est formée par l’alignement d’unités contractiles élémentaires nommées sarcomères. La cellule musculaire striée a la forme d’un fuseau d’environ 50 microns de diamètre et pouvant atteindre 50 cm de long, elle est issue de la fusion des myoblastes. Les cellules musculaires striées peuvent contenir plusieurs milliers de noyaux, situés en périphérie de la cellule, contre la membrane plasmique aussi appelée sarcolemme. Au sein du cytoplasme, les myofibrilles confèrent un aspect strié aux muscles squelettiques du fait de l’alignement des sarcomères. Entre les myofibrilles, le cytoplasme restant est nommé sarcoplasme et contient des organites
telles que des mitochondries alignées le long des myofibrilles, fournissant l’ATP nécessaire à la fonction contractile, et des molécules telles que le glycogène permettant le stockage du glucose, des molécules de myoglobines fixant l’oxygène, des protéines du cytosquelette assurant la cohésion des faisceaux de myofibrille. 1.4.2. Composante conjonctive : Les fibres musculaires striées sont groupées en faisceaux et sont réunies et entourées par un tissu conjonctif formant plusieurs tuniques. L’épimysium revêt le muscle dans son entier, le périmysium entoure chaque faisceau et l’endomysium entoure chaque fibre musculaire. On trouve également des amas d’adipocytes au sein du périmysium. Le tissu musculaire et le tissu conjonctif de soutien sont reliés au squelette par les tendons, formation de tissu conjonctif dense dont les fibres de collagène adhèrent à l’épimysium mais aussi a la membrane basale des fibres musculaires les plus longues. 1.4.3. Vascularisation : Des vaisseaux sanguins (artérioles et veinules) circulent dans les cloisons conjonctives du périmysium et forment un réseau capillaire artérioveineux au niveau de l’endomysium. Ce réseau entoure chaque fibre musculaire. 1.4.4. Innervation : Innervation motrice : chaque cellule musculaire est innervée par une fibre nerveuse motrice -issue d’un motoneurone alpha (neurone stimulant la partie extrafusoriale de la fibre). Le corps cellulaire de chaque motoneurone alpha est localisé dans la corne antérieure de la moelle épinière et envoie un axone dont chacune des terminaisons forme une synapse au niveau de la jonction neuromusculaire. Chaque motoneurone commande ainsi plusieurs fibres musculaires via l’arborisation axonale terminale. Le neurotransmetteur des jonctions neuromusculaires est l’acétylcholine et les récepteurs de l’acétylcholine sont localisés sur la membrane plasmique des fibres musculaires. La précision du mouvement dépend du nombre de fibres innervées par un motoneurone. - Innervation sensitive : le muscle strié est également innervé par des fibres nerveuses sensitives qui font synapse au niveau de deux structures équipées de mécanorécepteurs : les fuseaux neuromusculaires et les organes neurotendineux. Les fuseaux neuromusculaires sont des récepteurs sensoriels encapsulés, répondant au degré de tension et à la vitesse d’étirement du muscle. 1.5. La régénération musculaire Durant les stades précoces du développement, les fibres primaires et secondaires qui prennent place respectivement aux stades embryonnaire et fœtal sont issues de cellules précurseur
embryonnaires ou fœtales originaires des somites. La disparition du compartiment somitique à l’âge adulte laisse penser qu’il subsiste dans le muscle squelettique mature des précurseurs capables d’assurer l’homéostasie tissulaire en réponse à un traumatisme, à une nécrose ou encore durant la croissance post-natale. L’activation des cellules satellites (dites satellites car juxtaposées aux fibres musculaires sous la lame basale), par des facteurs microenvironnementaux tels que HGF (Hepatocyte growth Factor), LIF (Leukemia inhibitory Factor), Il-6 (Interleukine-6), FGF-2 (Fibroblast Growth Factor 2), FGF-6, IGF-I (Insulin Growth Factor), IGF-II, et pouvant être produits par les macrophages lors d’une réaction inflammatoire (Merly, Lescaudron et al. 1999) conduit à une prolifération active, on parle alors de myoblastes. Les myoblastes fusionnent entre eux ou avec des fibres préexistantes et génèrent ainsi de nouvelles fibres musculaires fonctionnelles. Les facteurs de régulation myogéniques intervenant durant la régénération sont les mêmes qu’aux stades embryonnaires ou fœtaux : les MRF. L’étape de fusion des myoblastes soit avec un myotube existant, soit avec un autre myoblaste se fait selon deux mécanismes différents. La fusion myoblaste/myotube fait intervenir l’Il-4 produite par les myotubes et le récepteur à l’Il-4 présent à la surface des myoblastes (Horsley, Jansen et al. 2003). La fusion myoblaste/myoblaste fait intervenir des protéines transmembranaires, en particulier la M- et la N-cadhérine et des intégrines avec principalement la b1-intégrine (Schwander, Leu et al. 2003). 1.6. Immunobiologie du muscle L’obtention simple et rapide de myoblastes ou de myotubes en culture en font un modèle intéressant pour étudier les propriétés immunobiologiques du muscle in vitro. Les cellules musculaires ont des propriétés immunologiques particulières leur permettant des interactions avec le système immunitaire. Tout d’abord, les myoblastes humains partagent quelques propriétés avec les cellules présentatrices de l’antigène impliquées dans la captation et la présentation de l’antigène. Aussi, les myoblastes expriment de façon constitutive des cytokines proinflammatoires et des chimiokines. Ils peuvent donc répondre à un stimulus inflammatoire en augmentant la synthèse de facteurs solubles déjà secrétés ou en produisant de nouvelles cytokines, chimiokines ou molécules d’adhésion (CAM). 1.6.1. Expression de molécules HLA En culture les myoblastes expriment de façon constitutive les molécules classiques HLA I (HLA-A, -B, -C). Le niveau d’expression de HLA I est augmenté en présence de cytokines proinflammatoires telles que l’IFNg, le TNFa, l’Il1a, l’Il1b et est diminué en présence de TGFb. Par ailleurs, la présence d’IFNg permet l’induction de l’expression de l’antigène HLA II (HLA-DR, -DQ, -DP). (Mantegazza, Hughes et al. 1991; Roy, Dansereau et al. 1991; Michaelis, Goebels et al. 1993; Nagaraju, Raben et al. 1998)
