MINISTERE DE LA JEUNESSE DE L'EDUCATION NATIONALE
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Niveau: Supérieur
MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE Présenté par Laurence THERAULAZ Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes ETUDE DE LA RÉGULATION DU SYSTÈME RESPIRATOIRE TMAO RÉDUCTASE CHEZ ESCHERICHIA COLI Soutenu le 22 février 2007 devant le jury suivant : Madame Laurence Mathieu Présidente Monsieur Frédéric Boccard Examinateur Monsieur Vincent Méjean Examinateur Monsieur Andràs Paldi Examinateur Laboratoire EPHE (Sciences de la Vie et de la Terre) : Laboratoire de Biologie Moléculaire Quantitative Directeur : Dr. Andràs PALDI GENETHON 1 bis rue de l'Internationale BP 60 91002 Evry cedex Laboratoire d'accueil : Laboratoire de Chimie Bactérienne Directeur de stage : Dr. Vincent MEJEAN CNRS UPR 9043 31 chemin Joseph Aiguier 13402 Marseille cedex 20 Résumé : Afin d'assurer sa croissance et d'adapter son métabolisme aux conditions environnementales, la bactérie aérobie-anaérobie facultative Escherichia coli est capable d'utiliser différents accepteurs terminaux d'électrons pour sa respiration. Elle possède ainsi une chaîne respiratoire, la chaîne TMAO réductase, lui permettant d'utiliser l'oxyde de triméthylamine (TMAO) que l'on trouve en abondance EPHE Banque de Monographies SVT 1
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MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE Présenté par Laurence THERAULAZ Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes ETUDE DE LA RÉGULATION DU SYSTÈME RESPIRATOIRE TMAO RÉDUCTASE CHEZ ESCHERICHIA COLI Soutenu le 22 février 2007 devant le jury suivant : Madame Laurence Mathieu Présidente Monsieur Frédéric Boccard Examinateur Monsieur Vincent Méjean Examinateur Monsieur Andràs Paldi Examinateur Laboratoire EPHE (Sciences de la Vie et de la Terre) : Laboratoire de Biologie Moléculaire Quantitative Directeur : Dr. Andràs PALDI GENETHON 1 bis rue de l'Internationale BP 60 91002 Evry cedex Laboratoire d'accueil : Laboratoire de Chimie Bactérienne Directeur de stage : Dr. Vincent MEJEAN CNRS UPR 9043 31 chemin Joseph Aiguier 13402 Marseille cedex 20 Résumé : Afin d'assurer sa croissance et d'adapter son métabolisme aux conditions environnementales, la bactérie aérobie-anaérobie facultative Escherichia coli est capable d'utiliser différents accepteurs terminaux d'électrons pour sa respiration. Elle possède ainsi une chaîne respiratoire, la chaîne TMAO réductase, lui permettant d'utiliser l'oxyde de triméthylamine (TMAO) que l'on trouve en abondance EPHE Banque de Monographies SVT 1
- métabolisme aux conditions environnementales
- système respiratoire dans le métabolisme bactérien
- tmao via le phosphorelais tors
- electron
- régulation du système tmao
- protéine
- système respiratoire
- accepteurs d'électrons exogènes
- réductases
MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE Présenté par Laurence THERAULAZ Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes ETUDE DE LA RÉGULATION DU SYSTÈME RESPIRATOIRE TMAO RÉDUCTASE CHEZ ESCHERICHIA COLI Soutenu le 22 février 2007 devant le jury suivant : Madame Laurence Mathieu Présidente Monsieur Frédéric Boccard Examinateur Monsieur Vincent Méjean Examinateur Monsieur Andràs Paldi Examinateur Laboratoire EPHE (Sciences de la Vie et de la Terre) : Laboratoire de Biologie Moléculaire Quantitative Directeur : Dr. Andràs PALDI GENETHON paldi@genethon.fr 1 bis rue de l'Internationale BP 60 91002 Evry cedex Laboratoire d'accueil : Laboratoire de Chimie Bactérienne Directeur de stage : Dr. Vincent MEJEAN CNRS UPR 9043 mejean@ibsm.cnrs-mrs.fr 31 chemin Joseph Aiguier 13402 Marseille cedex 20 Résumé : Afin d’assurer sa croissance et d’adapter son métabolisme aux conditions environnementales, la bactérie aérobie-anaérobie facultativeEscherichia coli est capable d’utiliser différents accepteurs terminaux d’électrons pour sa respiration. Elle possède ainsi une chaîne respiratoire, la chaîne TMAO réductase, lui permettant d’utiliser l’oxyde de triméthylamine (TMAO) que l’on trouve en abondance
dans le milieu marin et en particulier dans les tissus des animaux marins. Durant la respiration, le TMAO est réduit en triméthylamine (TMA), un composé en grande partie responsable de l’odeur nauséabonde des poissons en voie de décomposition. Le système respiratoire Tor comprend une TMAO réductase périplasmique TorA, un cytochrome de typec, TorC et une protéine chaperon TorD. Ces protéines sont codées par l’opérontorCAD dont l’expression est sous le contrôle strict de la présence de TMAO et fait intervenir le système de régulation à deux composants TorS/TorR. Le senseur TorS détecte le TMAO et transphosphoryle le régulateur de réponse TorR par un mécanisme de phosphorelais en quatre étapes. TorR ainsi activé va induire l’expression de l’opérontorCAD. Le but de ce travail a été de rechercher, d’une part, de nouveaux éléments de régulation intervenant sur le système Tor, et d’autre part, d’autres gènes régulés par le TMAO via le phosphorelais TorS/TorR en même temps que l’opérontor. Nous voulions ainsi essayer de mieux comprendre l’intégration de ce système respiratoire dans le métabolisme bactérien ainsi que ses conditions d’induction. Différentes approches génétiques ont permis de montrer qu’à la différence des autres systèmes respiratoires, le système Tor est utilisé par le colibacille aussi bien en aérobiose qu’en anaérobiose. L’induction des gènes codant pour ce système est liée à la phase exponentielle de croissance et les résultats obtenus ont permis de montrer qu’un niveau précis de superhélicité de l’ADN était requis pour avoir une induction optimale. La boîte -10 du promoteurtorcontient un site GATC de méthylation. La mutagenèse ciblée de ce site indique que la méthylation de la boîte 10 module l'activité du promoteur probablement en diminuant l'affinité de l’ARN polymérase-s70pour ce dernier. L'utilisation de la technique des puces à ADN a montré l'induction par le TMAO, via le phosphorelais TorS/TorR, du système tryptophanase (Tna). Nous avons ainsi pu déterminer le rôle joué par la tryptophanase (TnaA) dans la lutte contre le stress alcalin provoqué par la réduction du TMAO en TMA, composé très alcalin. La bactérie utilise donc ce système Tna pour anticiper la montée du pH dans le milieu et préserver sa survie. Mots-Clés: Escherichia coli microbiologie moléculaire régulation génétique respiration bactérienne
TABLE DES MATIERES Liste des abréviations INTRODUCTION BIBLIOGRAPHIQUE 1. Une bactérie modèle :Escherichia coli 2. Les systèmes respiratoires chez les bactéries 2.1. Généralités 2.2. Composition des chaînes respiratoires 3. La respiration chezEscherichia coli 3.1. La respiration aérobie 3.1.1. La cytochromebooxydase 3.1.2. La cytochromebdoxydase 3.1.3. La cytochromebxoxydase 3.2. La respiration anaérobie 3.2.1. Les nitrate
réductases 3.2.1.1. La nitrate réductase NarA 3.2.1.2. La nitrate réductase NarZ 3.2.1.3. La nitrate réductase périplasmique NapA 3.2.2. Les nitrite réductases 3.2.3. La fumarate réductase 3.2.4. La DMSO réductase 3.3. La régulation par l’oxygène des systèmes respiratoires 3.3.3. La protéine FNR 3.3.4. Le système ArcB/ArcA 4. La transduction des signaux environnementaux par les systèmes à deux composants ou phosphorelais 4.1. Introduction 4.2. Organisation des phosphorelais 4.3. Les différents types de phosphorelais 4.3.1. Les phosphorelais classiques 4.3.2. Les phosphorelais complexes 4.4. Répartition des phosphorelais dans le monde vivant 4.5. Fonctionnement des phosphorelais 4.5.1. Détection du signal par le senseur 4.5.2. Transduction du signal 4.5.3. Transmission du signal au sein du senseur 4.5.4. Activation du régulateur de réponse 4.5.5. Régulation de l’activité des phosphorelais 5. Le système respiratoire TMAO réductase 5.1. Le TMAO 5.2. Description du système TMAO réductase 5.2.1. Fonction de l’enzyme TorA 5.2.2. Biosynthèse et maturation de TorA 5.2.3. Fonction du cytochrome de typecTorC 5.2.4. Biosynthèse et maturation du cytochrome de typecTorC 5.3. Organisation génétique du système TMAO réductase 5.4. Régulation du système TMAO réductase 5.4.1. Régulation par l’oxygène 5.4.2. Régulation par le TMAO 5.4.2.1 La protéine senseur TorS 5.4.2.2 régulateur de réponse TorR Le 5.4.2.3 protéine TorT La 5.4.3. Régulation par l’intervention de protéines auxiliaires 5.4.3.1 négatif par l'apoprotéine TorC Rétrocontrôle 5.4.3.2 L'antirégulateur de réponse TorI Liste des abréviations : ADN : acide désoxyribonucléique ADNc : ADN complémentaire ARN : acide ribonucléique ATP : adénosine tri-phosphate CFU : Unité Formant Colonie CmR: résistant au chloramphénicol Dam : ADN adénine méthyltransférase
DMQ : déméthylménaquinone DMSO : diméthyl sulfoxyde dNTP : Désoxyribonucléotide triphosphate DO600: densité optique mesurée à 600nm E’0: potentiel d’oxydo réduction E. coli:Escherichia coli FLP : flipase recombinase frt : FLP recognition target Kb : kilobase kDa : kilodalton LB : Luria Broth (milieu de culture riche) MQ : ménaquinone mV : millivolts oligos : oligonucléotides ORF : Open-reading Frame pb : paires de bases PCR : Polymerase Chain Reaction qPCR : PCR en temps réel qsp : quantité suffisante pour rpm : rotation par minute RT : reverse transcription TM : domaine transmembranaire TMA : triméthylamine TMAO : oxyde de triméthylamine TNA : tryptophanase UQ : ubiquinone
1. Une bactérie modèle :Escherichia coli Escherichia coli relation de est une entérobactérie mobile, à gram négatif, développant une commensalisme avec son hôte. Elle fait partie de la flore commensale de l’intestin de l’homme et de nombreux animaux à sang chaud et est la première bactérie à coloniser l'intestin du nouveau-né. Son génome, composé de 4,7 millions de paires de bases, forme un chromosome unique et circulaire sur lequel sont organisés environ 4300 gènes. A l’instar des bactéries à gram négatif,E. colipossède une double membrane. La membrane externe, en contact direct avec le milieu extérieur, est composée d’une double couche de phospholipides et contient de nombreuses protéines dont des porines chargées d’assurer le passage de molécules hydrophiles en formant des canaux. La membrane interne est également composée d'une double couche phospholipidique hydrophobe dont la perméabilité est rendue possible par la présence de protéines dénommées perméases. De nombreuses enzymes et notamment celles qui interviennent dans le métabolisme énergétique sont insérées dans cette membrane. Entre ces deux membranes se trouve le périplasme. Il contient une mince couche de peptidoglycane et un espace dans lequel s'accumulent des enzymes capables de dégrader des substances prélevées dans le milieu extérieur et nécessaires au métabolisme de la bactérie, des enzymes de détoxification (vis-à-vis des antibiotiques par exemple), des protéines affines pour des sucres, des acides aminés, des vitamines ou des minéraux dont elles
