MINISTERE DE LA JEUNESSE DE L'EDUCATION NATIONALE
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2004
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Niveau: Supérieur
MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE Présenté par Stéphane DUPAS Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes Recherche de gènes induits par des facteurs de transcription à homéodomaines dans le système nerveux murin Soutenu le 26 mai 2004 devant le jury suivant : Dr Alain Privat – Président Dr Susan Saint-Just – Rapporteur Dr Marie-Claude Potier - Examinateur Dr Michel Volovitch - Examinateur Laboratoire de Biologie Moléculaire Directeur : Andràs PALDI EPHE (Sciences de la Vie et de la Terre) Développement et Evolution du Système Nerveux Directeur : Alain Prochiantz CNRS UMR 8542 Resp. Scientifique : Michel Volovitch Ecole Normale Supérieure 46 Rue d'Ulm 75005 Paris ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE Recherche de gènes induits par des facteurs de transcription à homéodomaines dans le système nerveux murin. EPHE Banque de Monographies SVT 1
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MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE Présenté par Stéphane DUPAS Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes Recherche de gènes induits par des facteurs de transcription à homéodomaines dans le système nerveux murin Soutenu le 26 mai 2004 devant le jury suivant : Dr Alain Privat – Président Dr Susan Saint-Just – Rapporteur Dr Marie-Claude Potier - Examinateur Dr Michel Volovitch - Examinateur Laboratoire de Biologie Moléculaire Directeur : Andràs PALDI EPHE (Sciences de la Vie et de la Terre) Développement et Evolution du Système Nerveux Directeur : Alain Prochiantz CNRS UMR 8542 Resp. Scientifique : Michel Volovitch Ecole Normale Supérieure 46 Rue d'Ulm 75005 Paris ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE Recherche de gènes induits par des facteurs de transcription à homéodomaines dans le système nerveux murin. EPHE Banque de Monographies SVT 1
- megalo virus
- analyse médicale
- protéine
- pcr polymerase
- tests sur cellules en culture
- technique des puces
- indolyl-phosphate
- phosphate buffer
- arn acide
MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L’EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre
MEMOIRE Présenté par Stéphane DUPAS Pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes Recherche de gènes induits par des facteurs de transcription à homéodomaines dans le système nerveux murin
Soutenu le 26 mai 2004 devant le jury suivant : DrAlain Privat Président DrSusan Saint-Just Rapporteur DrMarie-Claude Potier - Examinateur DrMichel Volovitch - Examinateur Laboratoire de Biologie Moléculaire Directeur : Andràs PALDI EPHE (Sciences de la Vie et de la Terre) Développement et Evolution du Système Nerveux Directeur : Alain Prochiantz 42 CNRS UMR 85 Resp. Scientifique : Michel Volovitch Ecole Normale Supérieure mivolovi@wotan.ens.fr 46 Rue d’Ulm 75005 Paris
ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE Recherche de gènes induits par des facteurs de transcription à homéodomaines dans le système nerveux murin.
DUPAS Stéphane 26 mai 2004 L’étude du développement du cerveau est demeurée longtemps restreinte à la description d’apparitions et disparitions de structures. Depuis plusieurs années, diverses techniques ont permis de comprendre ces évolutions aux niveaux cellulaire et moléculaire. Plusieurs homéoprotéines, protéines ayant une partie de séquence très conservée, ont été mises en évidence pour être impliquées dans diverses régulations. Ces protéines à homéodomaines sont des facteurs de transcription. Leur expression précoce persiste pour certaines chez l’adulte avec un rôle encore inconnu. Nous avons développé trois outils complémentaires dans l’optique d’étudier le rôle d’homéoprotéines chez des souris et des rats adultesin vivo(i) Nous avons mis en place la technique. des puces à ADN au sein de L’ENS pour l’étude du transcriptome de souris en développant certains aspects liés à la sensibilité. (ii) Nous avons pris le risque de développer un système innovant de transfection de cellulesin vivo de, adaptable à tous les types cellulaires et permettant de transfecter grands fragments d’ADN. Ce système est basé sur l’utilisation de la pénétratine, un peptide transducteur développé au laboratoire, et d’un bactériophage l comme “ cheval de Troie .(iii) Nous avons réalisé des gains de fonction en injectant l’homéoprotéine Engrailed 2in situ le cerveau dans de rat adulte selon des coordonnées stéréotaxiques précises, après l’avoir préalablement produite et purifiée. J’ai été un des principaux acteurs dans le développement de la technologie des puces à ADN au sein de l’Ecole Normale Supérieure pour l’étude du transcriptome de souris, ceci à tous les échelons : gestion des sondes, développement d’outils de spotting, amélioration de la sensibilité des méthodes de marquage des cibles, vérification de la qualité de l’ensemble du système. Ce travail originellement artisanal est devenu suffisamment performant pour être maintenant géré par une “ plate-forme génomique reconnue en France. Le second outil développé qu’est le système de transfection par couplage d’un peptide cellule-perméant avec un bactériophage lambda a montré des résultats positifs sur des cellules épithéliales (MDCK) et des neurones en culture puisque nous avons pu vérifier l’internalisation des phages ainsi que détecter une protéine rapportrice (la GFP) dont le gène est inséré dans le génome du bactériophage. Des tests préliminairesin vivoont également mis en évidence que ce système fonctionne dans le cerveau de souris adultes. Quant à l’injection de protéines par stéréotaxie, le troisième outil mis en place, nous avons pu déterminer une localisation principalement cytoplasmique, mais aussi neuritique de l’homéoprotéine Engrailed 2in vivo dans le système dopaminergique. MOTS-CLES : homéoprotéine, microarray, puce à ADN, vecteur, phage, système dopaminergique Introduction6 I- Position du problème scientifique6 II- Les techniques d’analyse de l’expression des ARNm10 1- Revue des principales techniques11 1-1 Analyse par Northern blot11 1-2 Protection à la ribonucléase11 1-3 RT-PCR12 1-4 SAGE (Serial Analysis of Gene Expression)12
1-5 Differential display12 2- Les microarrays ou “ puces à ADN 13 2-1 Principe13 2-2 Fabrication des lames14 a- choix des clones14 b- amplification par PCR, choix des oligos15 c- spotting16 2-3 Préparation des cibles et hybridation16 a- choix des échantillons et préparation16 b- marquage des ARN17 c- hybridation18 2-4 Collecte des données, normalisation et analyse19 a- lecture de la lame ; stockage et traitement des images19 b- normalisation20 c- analyse et interprétation20 2-5 Quelques perspectives21 a- analyse de séquences21 b- utilisation pour le développement de drogues et l’analyse médicale21 c- génome entier22 d- publication des résultats22 III Vectorisation23 1- Revue des principales techniques de vectorisation25 1-1 La micro-injection25 1-2 La co-précipitation25 1-3 L’électroporation26 1-4 La biolistique26 1-5 Les liposomes27 1-6 Les virus27 2- Les peptides vecteurs28 2-1 Mise en évidence28 2-2 Mécanisme de vectorisation29 2-3 Exemples d’applications30 2-4 Application aux virus30
IV Adressage des protéinesin vivo 33 1- Production et purification des protéines33 2- Administration à des animaux vivants : stéréotaxie34
