MINISTERE DE LA JEUNESSE DE L'EDUCATION NATIONALE
30
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Français
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2006
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Niveau: Supérieur
MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la vie et de la terre MEMOIRE Présenté par Véronique BAJZIK Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes SUIVI IMMUNOLOGIQUE DES POPULATIONS LYMPHOCYTAIRES T SPECIFIQUES DU VIRUS D'EPSTEIN BARR APRES GREFFE DE CELLULES SOUCHES HEMATOPOIETIQUES ALLOGENIQUES Soutenu le 18 Décembre 2006 devant le jury suivant : Pr Jean-Claude Gluckman Président Pr Bruno Canque Rapporteur Dr Hélène Moins Tuteur scientifique Pr Antoine Toubert Examinateur Dr Guislaine Carcelain Examinateur Laboratoire d'Immunologie cellulaire et Immunopathologie Directeur : Pr JC Gluckman Sciences de la Vie et de la Terre Ecole Pratique des Hautes Etudes Laboratoire d'Immunologie et d'Histocompatibilité Chef de service : Pr D Charron Hôpital Saint Louis ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE SUIVI IMMUNOLOGIQUE DES POPULATIONS LYMPHOCYTAIRES T SPECIFIQUES DU VIRUS D'EPSTEIN BARR APRES GREFFE DE CELLULES SOUCHES HEMATOPOIETIQUES ALLOGENIQUES VÉRONIQUE BAJZIK RESUME Le virus d'Epstein Barr (EBV) est un virus dont le contrôle de la réactivation et l'ajustement EPHE Banque de Monographies SVT 1
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MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la vie et de la terre MEMOIRE Présenté par Véronique BAJZIK Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes SUIVI IMMUNOLOGIQUE DES POPULATIONS LYMPHOCYTAIRES T SPECIFIQUES DU VIRUS D'EPSTEIN BARR APRES GREFFE DE CELLULES SOUCHES HEMATOPOIETIQUES ALLOGENIQUES Soutenu le 18 Décembre 2006 devant le jury suivant : Pr Jean-Claude Gluckman Président Pr Bruno Canque Rapporteur Dr Hélène Moins Tuteur scientifique Pr Antoine Toubert Examinateur Dr Guislaine Carcelain Examinateur Laboratoire d'Immunologie cellulaire et Immunopathologie Directeur : Pr JC Gluckman Sciences de la Vie et de la Terre Ecole Pratique des Hautes Etudes Laboratoire d'Immunologie et d'Histocompatibilité Chef de service : Pr D Charron Hôpital Saint Louis ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE SUIVI IMMUNOLOGIQUE DES POPULATIONS LYMPHOCYTAIRES T SPECIFIQUES DU VIRUS D'EPSTEIN BARR APRES GREFFE DE CELLULES SOUCHES HEMATOPOIETIQUES ALLOGENIQUES VÉRONIQUE BAJZIK RESUME Le virus d'Epstein Barr (EBV) est un virus dont le contrôle de la réactivation et l'ajustement EPHE Banque de Monographies SVT 1
- evaluation de la taille des molécules hla sur gel d'acrylamide
- donneur intra familial
- réactivations virales
- ebv
- greffe de cellules souches hématopoïétiques
MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L’EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la vie et de la terre MEMOIRE Présenté par Véronique BAJZIK ou l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes P r
SUIVI IMMUNOLOGIQUE DES POPULATIONS LYMPHOCYTAIRES T SPECIFIQUES DU VIRUS D’EPSTEIN BARR APRES GREFFE DE CELLULES SOUCHES HEMATOPOIETIQUES ALLOGENIQUES
Soutenu le 18 Décembre 2006 devant le jury suivant: Pr Jean-Claude Gluckman Président Pr Bruno Canque Rapporteur Dr Hélène Moins Tuteur scientifique Pr Antoine Toubert Examinateur Dr Guislaine Carcelain Examinateur Laboratoire d’Immunologie cellulaire et Immunopathologie Directeur : Pr JC Gluckman Sciences de la Vie et de la Terre Ecole Pratique des Hautes Etudes Laboratoire d’Immunologie et d’Histocompatibilité Chef de service : Pr D Charron Hôpital Saint Louis
ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE SUIVI IMMUNOLOGIQUE DES POPULATIONS LYMPHOCYTAIRES T SPECIFIQUES DU VIRUS D’EPSTEIN BARR APRES GREFFE DE CELLULES SOUCHES HEMATOPOIETIQUES ALLOGENIQUES VÉRONIQUE BAJZIK
RESUME Le virus d’Epstein Barr (EBV) est un virus dont le contrôle de la réactivation et l’ajustement
thérapeutique posent des problèmes en greffe de CSHA. Sa réactivation est une complication sérieuse qui, associée à certains facteurs de risque, peut conduire à un syndrome lymphoprolifératif (PTLD), mortel dans 92% des cas. Actuellement, le traitement par le Rituximab, un anticorps anti CD20 humanisé, est l’approche thérapeutique antitumorale la plus utilisée. Dans ce travail, nous nous sommes intéressés au suivi de la réponse immunitaire T CD8+ dirigée contre le virus EBV. Nous avons pour cela utilisé des molécules HLA de classe I tétramériques présentant des peptides viraux et couplées à un fluorochrome, les « tétramères ». Le suivi immunologique par les tétramères a été réalisé simultanément à la recherche de la réactivation virale afin de mieux comprendre les mécanismes immunologiques mis en jeu et d’étudier la capacité des patients à répondre et à contrôler la prolifération virale. Les tétramères HLA A*0201, A*0301, A*1101, B*0702, B*0802 que nous avons produits, nous ont permis de suivre 56 patients greffés. Nos analyses et la détection du génome viral par PCR en temps réel, nous ont permis d’observer la cinétique de reconstitution immunitaire anti EBV face à la réactivation virale. En conclusion, la quantification de l’ADN viral dans les cellules, combinée à la numération de cellules T spécifiques de l’EBV par les tétramères HLA de classe I, fournit un diagnostic précoce du statut de la réactivation. Les résultats nous permettent de distinguer les patients capables de contrôler spontanément la réactivation virale, de ceux qui nécessitent un traitement spécifique précoce par Rituximab, en particulier les patients traités par ATG et les receveurs de sang de cordon. MOTS CLEFS : EBV, PTLD, Greffe de CSHA, reconstitution immune, tétramères, Rituximab.
LISTE DES ABRÉVIATIONS......................................................................................................... 5 LISTE DES TABLEAUX ET FIGURES............................................ I- INTRODUCTION......................................................................... 1) LA GREFFE DE ESLLULCE SSEUOHC POÏOMÉTAHSUEIQÉT NIGÉLOALSEUQ................................................ 7 1-1) Historique.......................................................................................................................... 7 1-2) Le Complexe Majeur d’Histocompatibilité............................................................................... 9 1-3) Reconstitution immunitaire après greffe de CSHA................................................................... 10 1-4) Le rejet de greffe, GvL et GvHD........................................................................................... 14 2) RISQUES INFECTIEUX APRÈS GREFFE DE ECLLLUSE SUOHCSE ÉTOÏUEIQÉMHOPATS................................... 17 2-1) Les infections bactériennes et fongiques................................................................................. 17 2-2) Les infections virales.......................................................................................................... 17 3) LE SYNDRÔME ARITIFLÉFPOORMYHPL POST GREFFE.......................................................................... 18 3-1) Le virus d’Epstein Barr...................................................................................................... 18 3-2) Définition et classification du PTLD..................................................................................... 22 3-3) Facteurs de risque et incidence du PTLD en greffe de CSH....................................................... 23 3-4) Traitements du syndrome lymphoprolifératif post greffe........................................................... 23 4) RÉPONSE IMMUNE À L’NOITCEFNI PAR L’EBV................................................................................. 25 4-1) Mécanismes moléculaires de la reconnaissance du virus par les lymphocytes T CD8+................... 25 4-2) La réponse lymphocytaire T CD8+ anti-virale........................................................................ 27 4-3) La réponse lymphocytaire T CD8+ anti-EBV.......................................................................... 28 5) SUIVI UQEGILONOMUIM DE LA ÉRCAITVATION DU VIRUSEBV.......................................................... 29
5-1) Méthodes de détection des lymphocytes T CD8+ spécifiques d’un antigène................................... 29 5-2) Applications..................................................................................................................... 30 5-3) Choix des épitopes............................................................................................................. 31 II- OBJECTIFS DU TRAVAIL.......................................................... III- MATERIELS ET METHODES................................................... 1) CTEORHO DES ATPSNTIE..................................................................... 1-1) Diagnostics................................................................................... 1-2) Age des patients............................................................................. 1-3) Conditionnements........................................................................... 1-4) Sérologies EBV des couples donneur-receveur...................................... 2) POINRATARPÉ DES ULESCELL............................................................... 3) LES MOLÉCULESHLADE CLASSEIRTÉTIQUEAMÉRS................................ 3-1) Production de protéines recombinantes.............................................. 3-2) Repliement de la molécule HLA de classe I.......................................... 3-3) Purification de la protéine............................................................... 3-4) Tétramèrisation............................................................................. 4) DÉTEOITCN ET ANAESYL DES OCPHESYTYMLT CD8................................ 4-1) Détection des lymphocytes T CD8 spécifiques à l’aide des tétramères...... 4-2) Calcul des fréquences et quantification des populations T spécifiques de virus 4-3) Suivi virologique............................................................................ IV- RESULTATS............................................................................. 1) SÉPIFÉCITIC DES ÉTMARTSERÈ ET DÉTECTION DE LA ÉROPSNEEBV.............. 2) SUIVI DE LA TIONTIVACAÉREBV......................................................... 2-1) Facteurs de risque de la réactivation EBV.......................................... 2-2) Délais de réactivation..................................................................... 3) SUIVI DE LA ITUTITSNNOCORE DE SPYMLOHYCETTYCOTTOXIQUES ANTIEBVAPRÈS GREFFE 3-1) Reconstitution immune anti-EBV....................................................... 3-2) Reconstitution immune anti-EBV et réactivation virale.......................... 3-3) Cinétique de la réactivation EBV, réponse cellulaire T et traitement par Rituximab. V- DISCUSSION.............................................................................. VI- ANNEXES.................................................................................. ANNEXE1: ARTICLECLAVE ET COLL.TTIONANTANSPLAR(2004).................... ANNEXE2 : PLOERTOCO DE ONPRÉPARATI DES PÉTORSENI DE CORPS D’IOUSNSCLIN ANNEXE3 : PROCOTOEL DE DLOFGNIERHLA............................................ ANNEXE4 : BNITOIIONYLAT DE LA MOLÉCULEHLA................................... ANNEXE5 : WESTERN BLOT................................................................... ANNEXE6 : TNÉRISATIOÉTRAM.............................................................. ANNEXE7 : ELAAUVONTI DE LA TAILLE DES MOLÉCULESHLASUR GEL D’RYLAMIDECA ANNEXE8 : POTORELOC MÈRARETÉTEBV................................................ Gestion des prélèvements........................................................................ Séparation des lymphocytes.................................................................... Congélation......................................................................................... Marquage des cellules........................................................................... ANNEXE9 : STULOSNOI ETTAPMNOS....................................................... Solutions............................................................................................. Tampons............................................................................................. VII- REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES......................................
