MINISTERE DE LA JEUNESSE DE L'EDUCATION NATIONALE
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MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE présenté par MACADRE Catherine pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes Analyse structurale et évolutive d'un cluster d'analogues de gènes de résistance chez Phaseolus vulgaris soutenu le 22 juin 2004 devant le jury suivant : PALDI Andras - Président MIGNOTTE Bernard - Rapporteur DRON Michel - Examinateur GEFFROY Valérie - Examinateur Institut de Biotechnologie des Plantes, Laboratoire de Phytopathologie Moléculaire Université Paris Sud, UMR 8618, 91405 Orsay cedex E-mail : Directeur d'études EPHE : MIGNOTTE Bernard Laboratoire de Génétique Moléculaire et physiologie Bt 630Universite de Versailles/Saint-Quentin, Bt Fermat 45 av. des Etats Unis, 78035 Versailles E-Mail : RESUME L'interaction P. vulgaris/C. lindemuthianum est particulièrement adaptée à l'étude de l'évolution des gènes de résistance car : (i) la diversité des formes sauvages et cultivées de P. vulgaris est bien EPHE Banque de Monographies SVT 1
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- mémoire
- exposé
MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE présenté par MACADRE Catherine pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes Analyse structurale et évolutive d'un cluster d'analogues de gènes de résistance chez Phaseolus vulgaris soutenu le 22 juin 2004 devant le jury suivant : PALDI Andras - Président MIGNOTTE Bernard - Rapporteur DRON Michel - Examinateur GEFFROY Valérie - Examinateur Institut de Biotechnologie des Plantes, Laboratoire de Phytopathologie Moléculaire Université Paris Sud, UMR 8618, 91405 Orsay cedex E-mail : Directeur d'études EPHE : MIGNOTTE Bernard Laboratoire de Génétique Moléculaire et physiologie Bt 630Universite de Versailles/Saint-Quentin, Bt Fermat 45 av. des Etats Unis, 78035 Versailles E-Mail : RESUME L'interaction P. vulgaris/C. lindemuthianum est particulièrement adaptée à l'étude de l'évolution des gènes de résistance car : (i) la diversité des formes sauvages et cultivées de P. vulgaris est bien EPHE Banque de Monographies SVT 1
- résistance
- gène de résistance
- région
- complexité génétique des loci de résistance
- locus b4
- répartition dans le génome des plantes des gènes de résistance et des séquences
- spécificité
- agent pathogène
MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE
ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE présenté par MACADRE Catherine pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes Analyse structurale et évolutive d'un cluster d'analogues de gènes de résistance chez Phaseolus vulgaris soutenu le 22 juin 2004 devant le jury suivant :
PALDI Andras - Président MIGNOTTE Bernard - Rapporteur DRON Michel - Examinateur GEFFROY Valérie - Examinateur
Institut de Biotechnologie des Plantes, Laboratoire de Phytopathologie Moléculaire Université Paris Sud, UMR 8618, 91405 Orsay cedex E-mail :p-uspbu.yoi@ferfdg.fr Directeur d'études EPHE : MIGNOTTE Bernard Laboratoire de Génétique Moléculaire et physiologie Bt 630Universite de Versailles/Saint-Quentin, Bt Fermat 45 av. des Etats Unis, 78035 Versailles E-Mail : mignotte@lune.uvsq.fr
RESUME L’interactionP. vulgaris/C. lindemuthianum est particulièrement adaptée à l'étude de l'évolution des gènes de résistance car : (i) la diversité des formes sauvages et cultivées deP. vulgarisest bien
caractérisée, (ii) de nombreux gènes de résistance spécifiques ont été identifiés, et enfin (iii) un phénomène de co-évolution entre la plante et le pathogène a été identifié à l'échelle des centres de diversité deP. vulgaris(Geffroy et al. 1999). Un locus de résistance, nommé locus B4, a été identifié au laboratoire. Ce locus regroupe des résistances spécifiques à 15 souches deC. lindemuthianum d’origine andine et méso-américaine, correspondant à au moins trois gènes de résistance spécifique (2 gènes andins,Co-y etCo-z, et 1 gène méso-américain,Co-9) et deux QTL de résistance (l’un d'origine andine et l’autre d’origine méso-américaine) (Geffroy et al. 2000). La coexistence de spécificités de résistance andine et méso-américaine reflète l'évolution différentielle et indépendante d'un locus complexe "ancestral" présent chez le haricot avant la séparation des deux pools géniques. Une stratégie "gènes candidats" a été développée dans le laboratoire, et a permis d’identifier la sonde PRLJ1 correspondant au domaine NBS des gènes de résistance isolés chez les plantes (Nucleotide Binding Site). Cette étude a révélé une famille multigénique qui se localise au niveau du locusB4 (Geffroy et al. 1999, 2000). Deux banques génomiques ont été construites. Une avec le génotype BAT93 représentant le pool génique méso-américain, l’autre avec le génotype JaloEEP558 représentant le pool génique andin. Le criblage de ces banques avec la sonde PRLJ1 a permis d'isoler 42 clones pour BAT93 et 28 clones pour JaloEEP558. Mon étude en vue de l'obtention du diplome EPHE a porté sur une région orthologue entre ces deux pools géniques portant huit gènes candidats de type NBS-LRR chez le génotype BAT93 et trois chez le génotype JaloEEP558. L’analyse du ratio dN/dS montre une pression de sélection pour la diversification au niveau des résidus prédits comme étant exposé aux solvants dans le motif consensus LRR. L’analyse des séquences RGA nous a permis de montrer que dans la région analysée, les paralogues ne se ressemblent pas plus entre eux que les orthologues. Ces résultats suggèrent qu’il existe pour cette famille de gène peu d’échanges génétiques entre les paralogues, ou que ces événements sont contre-sélectionnés. Une zone dupliquée de 7 Kb a également été mise en évidence, sur le contigBC, pool génique chez le génotype BAT93 issu du Méso-Américain. Cette duplication est probablement le résultat d’un crossing-over inégal, ce qui souligne l’importance de ces événements dans la dynamique du locus, même s’ils ont lieu en faible fréquence ou qu’ils sont contre-sélectionnés. TABLE DES MATIERES A :oducIntritno __________________________________________________________________ 5
A.I-Résistance génétique des plantes vis-à-vis d’un pathogène____________ 5 ___________________ A.I.1-La résistance horizontale 5 ____________________________________________________________________ _______________________________________________________________________ A.I.2-La résistance verticale 5 ______________________________________________________________________ A.I.2.1-Le modèle de Flor 6 A.I.2.2-Réaction d’hypersensibilité et induction des mécanismes de défenses______________________________ 6
A.II-Structure des gènes de résistance__________________________________________________ 6 _____________________________________________________________________ A.II.1-Les différents domaines 7 A.II.1.1-La région Leucine Rich Repeat (LRR)_____________________________________________________ 7 A.II.1.2-La région Nucleotide Binding Site (NBS)___________________________________________________ 8 A.II.1.3-Le domaine Toll Interleukin p (TIR)________________________________________________ Rece tor 8 (CC)___________________________________________________________ A.II.1.4-Le domaine Coiled Coil 8 A.II.2-Différentes classes des gènes de résistance____ 9 __________________________________________________ A.II.2.1-Gènes de résistance comprenant un domaine Nucleotide Binding Site (NBS) et des répétitions riches en leucine (LRR)__ 9 ____________________________________________________________ A.II.2.2-Gènes de résistance constitués d’une région Leucine Rich Repeat extracellulaire et d’un domaine ___________________________________________________________ transmembranaire : eLRR-TM 9 ________________________________________________________________________ A.II.2.3-Autres classes 9 A.II.3.4-Une classe particulière : les protéines de résistance tro q es__________________________________ 10 n ué _________________________________________________________________ A.II.3.4.1-Mise en évidence 10 A.II.3.4.2-Rôle potentiel des protéines tronquées dans la résistance__________________________________ 10 A.II.3.5-Mise en évidence de voies de transduction dans le mécanisme de résistance dépendantes de la structure de la p de résistance___________________________________________________________ rotéine 11 A.III-Deux exemples de déclenchement du mécanisme de résistance_________________________ 11 A.III.1-Un exemple d’interaction entre les régions NBS-LRR : le gène Rx _____________________________ 11 ___ A.III.2-Un exemple de cascade de transduction : le Gène Pto____________________________________________ 12 A.IV-Diversité et répartition dans le génome des plantes des gènes de résistance et des séquences dites analogues de gènes de résistance (RGA)__________________________________ 13 A.IV.1-Complexité génétique des loci de résistance___________________________________________________ 13 A.IV.1.1-Les spécificités à un agent pathogène donné sont souvent localisés dans des régions précises du génome__________________________________________________________________________ 13 A.IV.1.2-Des gènes de résistance à différents pathogènes sont regroupés dans g ____________________ le énome 13 A.IV.1.3- Un gène de résistance conférant une résistance vis à vis de deux agents pathogènes________ 14 ________ A.IV.1.4-Deux gènes de résistance homologues, deux agents pathogènes différents______ 14 __________________ A.IV.1.5-Répartition des QTL (Quantitatif Trait Loci) de résistance dans le génome_______________________ 14 A.IV.2-Complexité moléculaire des locus de résistance ______________________________________ 15 __________ A.IV.2.1-Le séquençage systématique des génomes_________________________________________________ 15 A.IV g d’Arabidopsis thaliana___________________________________________________ .2.1.1-Le énome 15 A.IV.2.1.2-Le génome du riz 16 ________________________________________________________________ 2.1.3-L’apport du séquençage systématique________________________________________________ A.IV. 16 ég___________________________________________________________________ A.IV.2.2-Les l umineuses 17 gruncatula______________________________________________________________ A.IV.2.2.1-Médica o t 17 A.IV.2.2.2-Phaseolus vulgaris_ ________________________________________________ 17 ________ ______ A.V- Evolution des clusters de gènes de résistance_______________________________________ 18 A.V.1-Recombinaisons géniques et intergéniques des clusters___________________________________________ 18 A.V.2-Identification dans la région LRR de résidus soumis à une pression de diversification___________________ 19 A.VI-Modèle étudié : interactions vu garis / colletotric___________ Phaseolu l hum lindemuthianum 19 AVI.1-La plante :Phaseolus vulgarisou haricot commun_____________________________________________ 19 A.V L’agent pathogène : ___________________________________________ 20 I.2-Colletotrichum lindemuthianum ________________________________________________________________ A.VI.3-La maladie : l’anthracnose 21 A.VI.4-Relation gène-à-gène suspectée 21 _____________________________________________________________ A.VII-Caractérisation génétique et moléculaire d’un locus complexe de résistance chezeoasPhsul vulgaris: le locus B4______________________________________________________ 22 A.VII. 1-Caractérisation génétique_________________________________________________________________ 22 _______________________________________________________________ A.VII.2-Caractérisation moléculaire 22
LISTE DES ABREVIATIONS
aa acide aminé ADN Acide DésoxiriboNucléique ADNc Acide DésoxiriboNucléique complémentaire Avr Avirulence CC Coiled Coils CM CentiMorgan °C degré Celcius dN substitution non synonyme dS substitution synonyme dNTP Désoxi-Nucléique-TriPhosphate HD Hydrophobic Domain HR Hypersensitive Response Kb Kilo paire de bases LAR Localized Acquired Resistance LOD Logarithm of the Odds ratio LRR Leucine Rich Repeat LZ Leucine Zipper ml millilitre min. minute NBS Nucleotide Binding Site ORF Open Reading Frame Pb paire de bases PCR Polymerase Chain Reaction pmole picomole QTL Quantitative Trai Loci RGA Resistance Gene Analogue RIL Recombinant Inbreed Line SAR Sytemic Acquired Resistance SDS Sodium Salin Citrate TIR Toll Interleukin Receptor
A : INTRODUCTION
Les plantes, au cours de leur évolution, ont dû résister aux agressions des agents pathogènes, tels que les champignons, les bactéries, les virus, les nématodes, les insectes. Malgré les nombreux agents pathogènes existant, seul un faible pourcentage des confrontations plantes et agents pathogènes aboutissent à l’invasion de la plante et au développement de la maladie (89). Néanmoins, près de 15 % des récoltes sont perdues suite aux invasions de microorganismes, et ce malgré l'emploi massif
de produits phytosanitaires qui ne sont pas sans conséquence pour l'environnement. De nombreuses études se sont développées sur la compréhension des mécanismes de résistance et/ou de défense de la plante, dans l’espoir de diminuer l’utilisation des produits phytosanitaires. La plante dispose d’un arsenal de défenses pour contrer ses agents pathogènes. Les premières défenses sont les barrières physiques. Une cire, appelée cuticule recouvre les feuilles ainsi qu’une enveloppe semi-rigide entoure chaque cellule végétale, la paroi pecto-cellulosique. Lorsque ces premières barrières sont franchies, interviennent alors les défenses dues aux résistances génétiques.
A.I-Résistance génétique des plantes vis-à-vis d’un pathogène Lorsque la plante ne fournit pas la niche écologique nécessaire au développement d’un agent pathogène donné, la plante ne peut pas être considérée comme hôte de cet agent pathogène. Ce type de résistance est la résistance non hôte (1 ,62). La résistance non hôte ne sera pas abordée dans ce mémoire. Lorsqu’un agent pathogène donné infecte un nombre restreint d’espèces botaniques, on parle d’espèces hôtesespèces hôtes, certains génotypes végétaux sont. Au sein de ces sensibles alors que d’autres sont résistants. Parmi les génotypes sensibles, le degré d’attaque de l’agent pathogène peut varier suivant le génotype. Vanderplank a formalisé le premier ces aspects quantitatifs (résistance horizontale) et qualitatifs (résistance verticale agression) de la résistance des plantes face à une parasitaire (158).
A.I.1-La résistance horizontale C’est une résistance plus ou moins forte dirigée contre un ensemble de souches d’un même agent pathogène. Cette résistance est qualifiée de racenon spécifique, générale, quantitative. Cette résistance est contrôlée par un ensemble de gènes, elle estmultigénique. Ce type de résistance ne sera pas abordé dans ce mémoire.
A.I.2-La résistance verticale Lorsqu’un cultivar est complètement résistant à certaines souches d’un agent pathogène, mais sensible à d’autres souches, la résistance est dite race spécifique. Cette résistance permet de distinguer les différentes races d’un agent pathogène. Ces résistancesspécifiques sontgénéralement monogéniquesexemple, la résistance s’effectue grâce à la synthèse par la plante Par (158 ,159). d’une toxine ou d’une enzyme lytique qui empêche le développement de l’agent pathogène, ou encore par des résistances dites de type gène-à-gène mises en évidence par Flor (49 ,126).
A.I.2.1-Le modèle de Flor Les bases génétiques de la spécificité race/cultivar ont été établies par Flor lors de l'étude de l’interaction entre le lin et le champignon phytopathogèneMelampsora lini, agent responsable de la rouille du lin (49 ,48). Un grand nombre des interactions spécifiques plantes/agents pathogènes est contrôlé par le modèle gène-à-gène. Ce modèle prédit que la résistance spécifique ou "race-cultivar"
se caractérise par l'action concertée de deux gènes dominants : le gène de résistance (R) chez la plante et le gène d'avirulence (Avr) spécifique correspondant chez l'agent pathogène. Lorsque les deux gènes sont présents et fonctionnels, l’agent pathogène ne peut pas se développer, l’interaction est dite incompatible.
A.I.2.2-Réaction d’hypersensibilité et induction des mécanismes de défenses Dans la plupart des cas, une réaction d'hypersensibilité ou HR (Hypersensitive Response) est associée à cette résistance spécifique. La HR correspond à un processus de mort cellulaire, affectant la ou les cellules du site d'infection. La mort de la cellule stoppe ou ralentit l’invasion du pathogène. Cette mort cellulaire s’accompagne d’une augmentation de l’activité cellulaire (flux d’ions calcium, potassium et chlore, synthèse de protéases) et d’une mise en route des processus de défenses. Des signaux d’alerte sont transmis aux cellules adjacentes avec activation des cascades de défenses. Des protéines de défense sont synthétisées autour du site infectieux, c’est la résistance locale acquise (LAR) (75 ,60 ,52 ,76).
A.II-Structure des gènes de résistance Actuellement, le modèle de Flor est reconnu comme étant une interaction éliciteur-récepteur, chaque élément correspondant respectivement au produit du gène d’avirulence (Avr) de l’agent pathogène et au produit du gène de résistance (R) de la plante (78). Dans ce modèle, le gène Avr serait responsable de la production d’un éliciteur. Cette molécule serait reconnue par une autre molécule, le récepteur, produit par le gène R de la plante attaquée. Lors de la co-évolution entre les végétaux et les microorganismes phytopathogènes, les plantes ont développé des mécanismes de défense basés sur la reconnaissance de ces molécules, produites directement ou indirectement par le gène d’avirulence de l’agent pathogène (32). La perception d’éliciteurs par les récepteurs, déclenche une cascade de signalisation aboutissant à l’activation coordonnée de gènes de défense (172 ,118). La plupart des gènes de résistance connus à ce jour ont été isolés par clonage positionnel, par transposon tagging ou à l’aide de mutants. Plus récemment l’approche dite "gène candidat" s’est largement développée. de résistance spécifique isolés à partir d'espècesLa majorité des gènes végétales variées, codent des protéines présentant des domaines conservés : le domaine NBS (Nucleotide Binding Site) et le domaine LRR (Leucine Rich Repeat) (63,69 ). Deux autres domaines, Coiled Coil (CC) et Toll Interleukin Receptor (TIR) ont été mis en évidence. Ces deux motifs moins fréquents au sein des gènes de résistance identifiés, ont été mis en évidence dans la région N-terminale de la protéine, en amont des domaines NBS-LRR.
A.II.1-Les différents domaines
A.II.1.1-La région Leucine Rich Repeat (LRR) La région LRR est le plus souvent localisée du côté C-terminal de la protéine de résistance. Les LRR sont constituées de répétitions généralement de 20 à 29 résidus riches en leucine. Ces répétitions
contiennent un segment de 11 acides aminés formant un motif consensus LxxLxLxxN/C/TxL (x représente un acide aminé variable et L peut être une leucine, une valine, une isoleucine ou une phenylalanine) (85).Chez les mammifères, une protéine LRR très étudiée constituée à 90% de LRR, la protéine de porc PRI (Ribonucléase Inhibitor Porcine), a été visualisée en structure tridimensionnelle (83 ,84). Les répétitions LRR forment une structure dite en feuillet b /hélice a séparée par deux boucles. Les feuillets b sont sur la face interne et les hélices a sur la face externe. Cette structure est stabilisée par les interactions entre acides aminés. La structure tridimensionnelle de l’ensemble est en forme de fer à cheval. La protéine est composée d’une face interne constituée de résidus conservés formant la "colonne vertébrale" et d’une face externe exposée aux solvants, constituée de résidus hypervariables impliqués dans la spécificité de fixation de ligands. Au cours de l’interaction de la PRI avec la ribonucléase A, les points de contact se font au niveau du feuilletb (84). La structure des LRR des végétaux présente chez les gènes de résistance, est un peu différente de celle de la PRI car ces LRR ne possèdent pas de motif hélice a ou de petites régions pouvant prendre ce type de structure. Cependant, la succession des motifs feuillets b et boucles b confère une structure faiblement incurvée à la région LRR, avec une région exposée aux solvants, constituée de résidus hypervariables et une région interne composée de résidus conservés (112). Chez les gènes de résistance isolés à ce jour, le nombre de répétitions riches en Leucine peut varier de 14 à plus de 40 (69). Chez les mammifères, les LRR sont connues pour intervenir dans les interactions protéine /protéine (83).
A.II.1.2-La région Nucleotide Binding Site (NBS) Cette région est composée de trois motifs conservés présents dans des protéines intervenant dans la fixation pour l'ATP et/ou le GTP : les motifs P-loop (Phosphate binding loop, consensus : GVGKTT), Kinase 2 (consensus : LLVLDD) et Kinase 3 (consensus : GSRIIITTRD) (153). D’autres motifs conservés ont également été identifiés, le motif GLPL (ou HD : hydrophobic domain) et le motif MHDL présents dans toutes les protéines NBS-LRR (156). Dans cette région se situent également des motifs caractéristiques déduits des protéines de type TIR (Toll Interleukin Resistance) ou non TIR (cf A.II.2). Les protéines de résistance de type non TIR-NBS-LRR se caractérisent par la présence d’un motif RNBS-A non TIR (consensus : FDLxAWVCVSQxF), d’un résidu tryptophane (W) à la fin du motif kinase 2 et d’un motif RNBS-D non TIR (consensus : CFLYCALFPED) (108). Cette région NBS est homologue au facteur pro-apoptotique Apaf-1 (Apoptotic protease activating factor-1) des mammifères ainsi qu’à la protéine du nématode Ced-4 (Cell death factor 4) (155). Ces deux protéines Apaf-1 et Ced-4 sont des régulateurs de la mort cellulaire programmée (6).
A.II.1.3-Le domaine Toll Interleukin Receptor (TIR) Le domaine TIR présente d'importantes homologies de séquences avec les domaines de récepteurs protéiques isolés de la drosophile (récepteur Toll) et de l'homme (récepteur interleukine-I) (63). Ces récepteurs protéiques appelés TLR (Toll-like receptor) sont impliqués dans la réponse immunitaire. La cascade, appelée voie Toll pour la drosophile, présente des similarités avec la voie de signalisation Interleukine-I gouvernant l’activation de différents facteurs de transcription dont le facteur NF-kB
(nuclear factor kappa B) chez les mammifères. En particulier le récepteur transmembranaire Toll est homologue dans son domaine intracellulaire au récepteur interleukine-I (IL-1R) de mammifère (92 ,93). Sur la base de ces analogies, un rôle dans la cascade de signalisation cellulaire est généralement attribué au domaine TIR.
A.II.1.4-Le domaine Coiled Coil (CC) C’est une structure super enroulée constituée de sept résidus répétés avec deux amino-acides hydrophobes, et formant deux à cinq hélices a.Ce domaine CC est connu pour s’associer à un autre domaine CC d’une protéine identique ou différente pour former respectivement un homo ou un hétérodimère (14). Les protéines à Leucine zypper font partie de cette famille. Ces protéines se fixent au DNA sous forme de dimères. Elles comprennent deux régions, la région Leucine zipper et une région hélicoïdale basique. Ces deux régions sont responsables de la formation d’un dimère par l’association de deux longues hélices-a juxtaposées, reliées entre elles par des liaisons hydrophobes en plusieurs points évoquant un système à "fermeture éclair" (98)
A.II.2-Différentes classes des gènes de résistance La majorité de gènes de résistance code des protéines cytoplasmiques combinant un domaine récepteur et un domaine effecteur (63). Ils assumeraient deux fonctions majeures : la reconnaissance de molécules élicitrices par des mécanismes d'interactions protéine-protéine et la transmission de signaux (16). La comparaison des séquences des gènes de résistance, la construction de gènes chimériques et des expériences de mutation des gènes ont montré que la région LRR est impliquée, entre autre, dans la reconnaissance spécifique du facteur d’avirulence et serait donc le domaine récepteur (15 ,113,3 ,165 ).
A.II.2.1-Gènes de résistance comprenant un domaine Nucleotide Binding Site (NBS) et des répétitions riches en leucine (LRR) La classe majeure des gènes de résistance codent des protéines de typeNBS-LRR. Ils présentent à la fois des répétitions LRR en C-terminal et un domaine NBS en partie N-terminal, pour exemple le gènePib du pathogène riz qui confère la résistance à l’agentMagnaporthe grisea(164). Au sein de cette classe, certains gènes, en plus des domaines LRR et NBS, codent des protéines possédant ou non le motif TIR en position N-terminale. Les protéines correspondantes sont alors nommées respectivementTIR-NBS-LRRetnon TIR-NBS-LRR.Pour exemple, le gèneL6 du lin, qui confère la résistance au champignon phytopathogèneMelampsora lini, code une protéine de typeTIR-NBS-LRR(91). Le gèneI2c-1 de la tomate, qui confère la résistance au champignon phytopathogène Fusarium oxyporum(143), code une protéine avec des domaines CC en région N terminale. Il code une protéine de typenon TIR-NBS-LRR.
A.II.2.2-Gènes de résistance constitués d’une région Leucine Rich Repeat extracellulaire et d’un domaine transmembranaire : eLRR-TM Une autre classe, la classeeLRR-TMest représentée par les gènesCf de résistance au champignon
Cladosporium fulvum ou encore le gène(67 ,39)Ve résistance au champignon deVerticilium albo-atrum LRR prédites répétitions desde la tomate. Ces gènes codent des protéines comprenant (77) comme étant extracellulaires avec un domaine transmembranaire du côté C-terminal. Dans ce cas, les répétitions ont une séquence consensus qui présente quelques modifications par rapport à la séquence consensus des LRR intracytoplasmique.
A.II.2.3-Autres classes Parmi les gènes de résistance, certains codent des protéines dont la structure diffère et où, un ou peu d’exemplaires sont clonés à ce jour. Le gènePto fut le premier gène de résistance (103)de la tomate cloné, il code uneprotéine sérine thréonine kinase. Le gèneXa21du riz (146) code également une protéine sérine thréonine kinase mais avec des répétitionsLRR sa région C-terminale. dans Le gèneRPW8 d’Arabidopsis thaliana(70) code une protéine avec un domaine CC du côté N-terminal et un domaine transmembranaire du côté C-terminal (CC-TM). Le gèneMlo le blé code une chez protéine constituée d’un domaine transmembranaire formé de sept hélices (20).
A.II.3.4-Une classe particulière : les protéines de résistance tronquées A.II.3.4.1-Mise en évidence Chez les plantes, les premières molécules de ce type caractérisées ont été les produits du gène de résistanceNdans le tabac (166), deL6dans le lin (91 ,7). Ces produits nommés Ntret L6trsont des transcrits alternatifs obtenus à partir des gènesN etL6 respectivement, codant tous les deux une protéine de la classe TIR-NBS-LRR. Ces produits présentent les domaines TIR, NBS et un nombre restreint de répétitions LRR (91). ChezArabidopsis, le transcrit RPP5tr dans sa partie C-code une protéine de type TIR-NBS tronquée terminale à partir du motif HD présent dans le domaine NBS (121). Les 465 premiers aa de la protéine RPP5tr identiques à ceux de la protéine RPP5 et le 466 sonte de la protéine RPP5tr aa correspond à une tyrosine suivie d’un codon stop. La région qui suit ne présentent pas d’homologie tr avec la protéine RPP5 (121). Dans le cas du transcrit RPP5 , celui-ci provient d’un gène différent du transcrit RPP5. L’analyse de la séquence complète du génome d’Arabidopsis évidence 205 permis de mettre en a gènes codant des protéines avec des domaines homologues aux gènes de résistance (110). Parmi ces 205 gènes 57 ne possèdent pas de domaines LRR. A.II.3.4.2-Rôle potentiel des protéines tronquées dans la résistance Durant la réponse à la résistance au TMV (Tabacco Mosaic Virus) chez le tabac, une variation du ratio protéine complète(N)/protéine tronquée(Ntr suggère que les) a été observée (37). Ce résultat protéines pleines longueurs et tronquées sont nécessaires pour conférer la résistance au TMV. En revanche, dans le cas du gène de résistance L6, la transformation du lin avec un gène ne pouvant plus produire de molécules tronquées ne modifie pas sa résistance contre la rouille (7). Le rôle de ces molécules de petites tailles reste inconnu. Des résultats récents montrent que les TIR-
NBS et les TIR-X (sans le domaine NBS) sont exprimés dans des tissus différents. Ils sont tissus spécifiques suivant leur structure (110). La comparaison, pour les protéines possédant un motif TIR, avec le système immunitaire des mammifères, peut évoquer un rôle similaire à MYD88 (47). MYD88 est une protéine de mammifère, de petite taille, avec un motif TIR. C’est un adaptateur formant un complexe avec des composantes de signalisation des complexes récepteurs, les TLR (Toll Like Receptor), qui reconnaissent des structures microbiennes. Elles activent la voie de transduction de défenses (86).
A.II.3.5-Mise en évidence de voies de transduction dans le mécanisme de résistance dépendantes de la structure de la protéine de résistance ChezArabidopsis thaliana,transduction activant les gènes de défenses sont voies de plusieurs différenciées (57). Concernant la voie pour les résistances dites "gène-à-gène", trois voies de transduction sont distinguées. Une voie nécessite le gèneEDS1. Les mutants dans EDS1 bloquent la résistance conférée par les gènesRPW8, RPP2, RPP4, RPP5, RPP10, RPP14, RPS4. Tous ces gènes ont la particularité de posséder un domaine TIR (122). Une autre voie implique le gèneNDR1. Les mutants deNDR1 la résistance générée par les gènes bloquentRPM1, RPS2, RPS5, tous ces gènes appartiennent à la classe des non TIR-NBS-LRR (22 ,57). Cependant toutes les résistances dues aux gènes de type non TIR ne sont pas bloqués par les mutants deNDR1. Il existe donc au moins deux voies de transduction différentes dans la résistance "gène-à-gène" pour les protéines de type non TIR (105). Ces études suggèrent que le type de structure en partie N-terminale (TIR-NBS, CC-NBS ou NBS seul) est important pour la voie de signalisation utilisée dans la résistance (176). Dans la classe des Angiospermes (plantes à fleurs), les deux sous classes, monocotylédones et dicotylédones, ont divergé il y a environ 200 millions d’années (169). Malgré cela, les gènes clés connus chezArabidopsis les (dont résistance les différentes cascades de transduction pour la dans gènesEDS1etNDR1) à l’exception du gèneSNI1, ont au moins un homologue chez le riz, suggérant une forte conservation de ces voies de signalisation chez les monocotylédones et les dicotylédones (58).
A.III-Deux exemples de déclenchement du mécanisme de résistance
A.III.1-Un exemple d’interaction entre les régions NBS-LRR : le gène Rx Le gène Rx confère la résistance au virus X de la pomme de terre. Il est de type CC-NBS-LRR. En présence de la protéine de l’enveloppe virale (CP : Coat Protein) et du gène Rx, il y a production d’une HR dans le tabac (12). Bendahmaneet al.,2002, ont obtenu sept mutants, par la technique PCR, avec huit mutations ponctuelles indépendantes qui provoquent une HR en absence de l’éliciteur. Ces mutations sont localisées dans deux motifs conservés de la région NBS, le RNBS-D et le MHDL (les deux derniers motifs conservés de cette région), ainsi que dans la région LRR. Ces résultats suggèrent que les domaines NBS et LRR de la protéine native Rx portent des domaines inhibiteurs qui empêchent le déclenchement de la voie de signalisation pour la HR en absence d’éliciteur. Les auteurs supposent que les différents mutants constitutifs pour la HR adoptent une structure
conformationnelle équivalente à la protéine activée par l’éliciteur. Par ailleurs, la surexpression de la protéine native Rx ou délétée dans sa partie C-terminale à partir du domaine RNBS-D provoque une HR dans le tabac en l’absence de CP. En revanche, la surexpression de la protéine délétée dans sa partie N-terminale n’a plus la capacité d’induire la HR. Ces expériences suggèrent que les interactions entre la partie N-terminale de la protéine avant le domaine RNBS-D et la partie C-terminale de cette protéine jouent donc un rôle de régulation négative pour la production de la HR. Cependant, la délétion de la région LRR seule ne conduit pas à l’activation spontanée de la protéine Rx comme on pourrait l’attendre, ce qui suggère que la région LRR n’est pas seulement utile à la régulation négative de la protéine, mais également à la reconnaissance de l’éliciteur (114). La coexpression des domaines LRR et CC-NBS de la protéine Rx provoque une HR dépendante de la présence de la protéine CP. Le même résultat est obtenu lors de la coexpression de la région CC avec la région NBS-LRR de la protéine Rx dépendante de la protéine CP. La fonctionnalité de la protéine Rx est donc reconstituée avec les interactions physiques entre les domaines. L’activation de la protéine Rx implique la rupture de l’interaction entre les domaines NBS et LRR car l’interaction physique n’est plus observée en présence de CP (114). La reconnaissance de CP pourrait initier un changement de conformation de la protéine, impliquant une disruption de l’interaction entre les domaines NBS et LRR. La protéine Rx deviendrait alors compétente pour initier la signalisation.
A.III.2-Un exemple de cascade de transduction : le Gène Pto Le gène de résistancePtofut le premier gène de résistance cloné (101) chez les plantes. La cascade Pto constitue actuellement le modèle où les études sur les relations "gène-à-gène" sont les plus avancées. Pto code une protéine de type sérine thréonine kinase (paragraphe A.II .2.3). Des génotypes portant le gènePto de la bactériepossèdent une résistance totale aux souchesPseudomonas syringae pv. Tomatoexprimant le gène d’avirulence AvrPto (102). Des expériences de double hybride dans la levure ont montré que le produit du gènePto gène directement avec le produit du interagitAvrPto (138 ,150). Deux autres gènes ont été clonés au locus Pto (135), les gènesFen etPrf. Le gèneFen confère la sensibilité à un insecticide (le fenthion). C’est une protéine kinase de 318 aa. Il a 80% d’identité protéique avec Pto. Le gènePrf(Pseudomonas resistance and fenthion sensitive) code une protéine cytoplasmique de 1824 aa de type CC-NBS-LRR. Ce gènePrfa une position centrale au locus Pto. Il est à 24 kb du gènePtoet 500 pb du gèneFen. Des expériences d’échange de domaine entre les protéines Pto et Fen ont permis de mettre en évidence deux acides aminés indispensables à l’interaction des protéines Pto et AvrPto, la thréonine 204 et la tyrosine 207 localisées dans le domaine P-loop. Ce domaine P-loop est très conservé dans les kinases (50). Cette interaction a été confirmée par des expériences de mutations ponctuelles (127). Un ensemble de mutations ponctuelles ont démontré que le domaine P-loop est nécessaire à la liaison de Pto et AvrPto ainsi qu’à la transduction du signal. Ces travaux ont également montré que Prf interagit avec Pto et participerait à la reconnaissance de AvrPto. Un modèle a été proposé (14 ,32 ,61). La protéine Pto serait présente sous sa forme inactive dans le cytoplasme. La liaison AvrPto-Pto provoquerait une distorsion du domaine P-Loop et activerait Pto. Pto phosphorylerait ainsi d’autres protéines et activerait des mécanismes de défenses. L’éliciteur AvrPto serait libéré et
