MINISTERE DE LA JEUNESSE DE L'EDUCATION
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Français
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2006
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Niveau: Supérieur
MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE Transformation de souches de Mycoplasma mycoides subsp. mycoides «Small Colony» avec des plasmides réplicatifs pour inactivation ciblée de gènes Présenté par Sophie LORENZON (Laboratoire du CIRAD, UPR 15 Contrôle des maladies, TA30/G, 34398 Montpellier Cedex 5) Pour l'obtention du Diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes Soutenu le 19 décembre 2006 à Montpellier devant le jury suivant: Monsieur Thierry Dupressoir Président Monsieur Yves Benyamin Examinateur Monsieur François Poumarat Examinateur Monsieur François Thiaucourt Examinateur Tuteur scientifique: Dr Thiaucourt François () Laboratoire de Contrôle des maladies (Directeur D. Martinez). Laboratoire du CIRAD, UPR 15 Contrôle des maladies, TA30/G, 34398 Montpellier Cedex 5. Tuteurs pédagogiques: Dr Lebart Marie-Christine (), Dr Benyamin Yves (Directeur) (). Laboratoire de Motilité Cellulaire, EPHE-UMR 5539, Bt. 24/cc107/étage 4, USTL, place E. Bataillon F 34090 Montpellier EPHE Banque de Monographies SVT 1
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MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE Transformation de souches de Mycoplasma mycoides subsp. mycoides «Small Colony» avec des plasmides réplicatifs pour inactivation ciblée de gènes Présenté par Sophie LORENZON (Laboratoire du CIRAD, UPR 15 Contrôle des maladies, TA30/G, 34398 Montpellier Cedex 5) Pour l'obtention du Diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes Soutenu le 19 décembre 2006 à Montpellier devant le jury suivant: Monsieur Thierry Dupressoir Président Monsieur Yves Benyamin Examinateur Monsieur François Poumarat Examinateur Monsieur François Thiaucourt Examinateur Tuteur scientifique: Dr Thiaucourt François () Laboratoire de Contrôle des maladies (Directeur D. Martinez). Laboratoire du CIRAD, UPR 15 Contrôle des maladies, TA30/G, 34398 Montpellier Cedex 5. Tuteurs pédagogiques: Dr Lebart Marie-Christine (), Dr Benyamin Yves (Directeur) (). Laboratoire de Motilité Cellulaire, EPHE-UMR 5539, Bt. 24/cc107/étage 4, USTL, place E. Bataillon F 34090 Montpellier EPHE Banque de Monographies SVT 1
- mmmsc
- organisation de l'alimentation et de l'agriculture
- transformation de souches de mycoplasma mycoides
- gène
- lacza gène codant pour le peptide ? de la ? galactosidase
- mutagenèse dirigée avec plasmides réplicatifs
MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L’EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE Transformation de souches deMycoplasma mycoidessubsp.mycoides «Small Colony» avec des plasmides réplicatifs pour inactivation ciblée de gènes Présenté par Sophie LORENZON (Laboratoire du CIRAD, UPR 15 Contrôle des maladies, TA30/G, 34398 Montpellier Cedex 5) Pour l’obtention du Diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes
Soutenu le 19 décembre 2006 à Montpellier devant le jury suivant: Monsieur Thierry Dupressoir Président Monsieur Yves Benyamin Examinateur Monsieur François Poumara Examinateur t Monsieur François Thiaucourt Examinateur Tuteur scientifique: Dr Thiaucourt François (thiaucourt@cirad.fr) Laboratoire de Contrôle des maladies (Directeur D. Martinez). Laboratoire du CIRAD, UPR 15 Contrôle des maladies, TA30/G, 34398 Montpellier Cedex 5. Tuteurs pédagogiques: Dr Lebart Marie-Christine (bera@tnuvim-nopt2l.cfmr), Dr Benyamin Yves (Directeur) (noptvim-.2rfenbmiyaunn@). Laboratoire de Motilité Cellulaire, EPHE-UMR 5539, Bt. 24/cc107/étage 4, USTL, place E. Bataillon F 34090 Montpellier
ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE TRANSFORMATION DE SOUCHES DEMYCOPLASMA MYCOIDESSUBSP.MYCOIDES«SMALL COLONY» AVEC DES PLASMIDES REPLICATIFS POUR INACTIVATION CIBLEE DE GENES Sophie LORENZON Résumé La péripneumonie contagieuse bovine est une maladie respiratoire, infectieuse et contagieuse, due à un mycoplasme, bactérie sans paroi, du groupemycoides,Mycoplasma mycoidessubsp.mycoides biotype «Small Colony» (MmmAffectant les bovins, taurins, zébus, elle est considérée comme une prioritéSC). absolue par le programme de lutte contre les épizooties en Afrique. La création de mutants par les méthodes de transformation moléculaire par recombinaison homologue peut permettre de comprendre les mécanismes moléculaires de pathogénicité et éventuellement aboutir à des vaccins atténués, protecteurs, dotés d'une meilleure efficacité. En 2003, les premiers vecteurs génétiques stables pour trois pathogènes du groupemycoideset des recombinaisons homologues ont été obtenus avec des biotypes proches deMmmSC. A ce jour aucune étude n’a montré une recombinaison au niveau d’un gène cible chezMmmSC. Cette étude a porté sur la mise au point et l’optimisation de la méthode de transformation d’une souche pathogène deMmmSC (Rita) pour l’inactivation de gènes deMmmSC (lpp parB et IS1296) transformation du mycoplasme avec des plasmides réplicatifs contenant le gène cible tronqué. Après 30 passages des transformants sur milieu sélectif, les éventuels évènements de recombinaison ont été analysés par «Southern blot». La technique de transformation par la méthode au polyéthylène glycol a été réalisée avec succès et améliorée. Par contre, les transformants de la souche Rita ont présenté un plasmide persistant à l’état extra-chromosomique, et ce malgré un grand nombre de passages. Une stratégie alternative a été mise en œuvre en alternant des passages sans pression de sélection pour favoriser l’élimination de ce plasmide persistant à l’état extra-chromosomique et la sélection des recombinants. De nouveaux vecteurs de taille plus importante ont été utilisés, avec une nouvelle souche deMmmSC (Afadé). Les souches Rita et Afadé transformées avec le plasmide présentant la copie du gène tronquélppB, n’ont pas présenté d’événement de recombinaison après 15 passages. Les plasmides contenant la partie interne de l’IS1296 ont montré une instabilité accompagnée parfois d’une variation de la taille du vecteur. D’autre part, la première intégration par recombinaison homologue au niveau d’une IS chez ce microorganisme a été observée chez la souche Afadé et vérifiée par «Southern blot», PCR et séquençage. La présence multicopie de l’IS1296 pourrait expliquer cet événement de recombinaison. Mots-clés:péripneumonie,MmmSC, transformation, plasmide réplicatif, recombinaison, inactivation de gène, insertion IS1296. I INTRODUCTION 1 I.1 La péripneumonie contagieuse bovine (PPCB) 1 I.1.1 Histoire et répartition 1 I.1.2 Importance de la maladie et situation en Afrique 2 I.1.3 Modes de transmission 2 I.1.4 Symptômes 3 I.1.5 Lésions 3 I.1.6 Diagnostic 3
