MINISTÈRE DE L'ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE
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2009
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Niveau: Supérieur
MINISTÈRE DE L'ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE ÉCOLE PRATIQUE DES HAUTES ÉTUDES Sciences de la Vie et de la Terre MÉMOIRE Présenté par Nadia BELAÏDOUNI-COMBIER Pour l'obtention du diplôme de l'École Pratique des Hautes Études ÉTUDE DU MÉCANISME D'ACTION DE LA PROTÉINE VPR DU VIRUS: UN EXEMPLE DE DÉTOURNEMENT DU SYSTÈME UBIQUITINE-PROTÉASOME PAR UNE PROTÉINE VIRALE Soutenu le 1er décembre 2009 devant le jury suivant : -Président : Christophe Terzian - Rapporteur : Claudine Pique - Examinateur : Katy Janvier - Examinateur : Bruno Canque - Examinateur : Florence Margottin-Goguet Laboratoire EPHE: Directeur : Pr. Bruno CANQUE « Immunologie Cellulaire et immunopathologie » CNRS UMR 5171-IUH, centre Hayem 1 avenue C. Vellefaux 75010 Paris Laboratoire de l'Institut Cochin: Directeur : Dr. Florence Margottin-Goguet « Contrôle du cycle cellulaire et protéines virales » INSERM U567-CNRS UMR 8104 22 rue Méchain 75014 Paris RÉSUMÉ DES TRAVAUX : EPHE Banque de Monographies SVT 1
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- mémoire
MINISTÈRE DE L'ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE ÉCOLE PRATIQUE DES HAUTES ÉTUDES Sciences de la Vie et de la Terre MÉMOIRE Présenté par Nadia BELAÏDOUNI-COMBIER Pour l'obtention du diplôme de l'École Pratique des Hautes Études ÉTUDE DU MÉCANISME D'ACTION DE LA PROTÉINE VPR DU VIRUS: UN EXEMPLE DE DÉTOURNEMENT DU SYSTÈME UBIQUITINE-PROTÉASOME PAR UNE PROTÉINE VIRALE Soutenu le 1er décembre 2009 devant le jury suivant : -Président : Christophe Terzian - Rapporteur : Claudine Pique - Examinateur : Katy Janvier - Examinateur : Bruno Canque - Examinateur : Florence Margottin-Goguet Laboratoire EPHE: Directeur : Pr. Bruno CANQUE « Immunologie Cellulaire et immunopathologie » CNRS UMR 5171-IUH, centre Hayem 1 avenue C. Vellefaux 75010 Paris Laboratoire de l'Institut Cochin: Directeur : Dr. Florence Margottin-Goguet « Contrôle du cycle cellulaire et protéines virales » INSERM U567-CNRS UMR 8104 22 rue Méchain 75014 Paris RÉSUMÉ DES TRAVAUX : EPHE Banque de Monographies SVT 1
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- vih virus de l'immunodéficience humaine
- inhibition de la dégradation des substrats de la ?trcp………………………
- protéine
- arrêt en phase g2 du cycle
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- système ubiquitine-protéasome
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- cycle cellulaire
MINISTÈRE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE ÉCOLE PRATIQUE DES HAUTES ÉTUDES Sciences de la Vie et de la Terre MÉMOIRE Présenté par Nadia BELAÏDOUNI-COMBIER Pour l’obtention du diplôme de l’École Pratique des Hautes Études ÉTUDE DU MÉCANISME D’ACTION DE LA PROTÉINE VPR DU VIRUS: UN EXEMPLE DE DÉTOURNEMENT DU SYSTÈME UBIQUITINE-PROTÉASOME PAR UNE PROTÉINE VIRALE Soutenu le 1erdécembre 2009 devant le jury suivant : -Président : Christophe Terzian - Rapporteur : Claudine Pique - Examinateur : Katy Janvier Examinateur : Bruno Canque -- Examinateur : Florence Margottin-Goguet
Laboratoire EPHE: Directeur : Pr. Bruno CANQUE « Immunologie Cellulaire et immunopathologie » CNRS UMR 5171-IUH, centre Hayem 1 avenue C. Vellefaux 75010 Paris Laboratoire de l’Institut Cochin: Directeur : Dr. Florence Margottin-Goguet « Contrôle du cycle cellulaire et protéines virales » INSERM U567-CNRS UMR 8104 22 rue Méchain 75014 Paris RÉSUMÉ DES TRAVAUX :
L’activité la plus largement reconnue de Vpr, une protéine auxiliaire du VIH-1, concerne sa capacité à arrêter les cellules infectées en fin de phase G2 du cycle cellulaire, une phase durant laquelle la transcription du génome viral est optimale. Les données de la littérature s’accordent sur le fait que l’arrêt en transition G2/M résulte du maintien sous forme inactive du complexe Cdk1/cycline B, responsable de l’entrée des cellules en mitose. Certaines données de la littérature suggèrent que Vpr s’associe directement avec à des complexes ubiquitine ligases de type culline (ou CRUL pour Cullin-RING-Ubiquitin-Ligase): les cullines Cul-1 et Cul4A. Par ailleurs, ces complexes jouent un rôle majeur dans le contrôle du cycle cellulaire. En 2006, plusieurs publications décrivent une nouvelle famille de protéines appelée « DCAFs » (DDB1 Cul4A Associated Factor) qui en interagissant avec le complexe E3 ubiquitine ligase Cul4A-DDB1, jouent le rôle d’adaptateur entre la ligase et le substrat destiné à être dégradé par le protéasome. Parmi ces adaptateurs, nous nous sommes intéressés à la protéine DCAF-1, auparavant identifiée comme étant un partenaire d’interaction de Vpr. Nos travaux ont permis de mettre en évidence le rôle crucial de DCAF-1 dans l’arrêt en phase G2 du cycle cellulaire induit par Vpr. Notre groupe a été le premier à montrer que pour induire un arrêt en phase G2 du cycle cellulaire, Vpr s’associe à la protéine DCAF-1, afin de recruter le complexe E3 ubiquitine ligase Cul4A-DDB1 et cibler l’ubiquitinylation d’une protéine cellulaire pour être dégradée par le protéasome. TABLE DES MATIERES LISTE DES ABREVIATIONS
..
.... 4 AVANT-PROPOS
.. 6 INTRODUCTION
.. 8 I. LE SYSTÈME UBIQUITINE-PROTÉASOME
8 A. Le système ubiquitine-protéasome (UPS)
.
. 8 1. L’ubiquitinylation.
8 1.1 Assemblage de la chaîne d’ubiquitine
... 8 1.2 Cascade enzymatique
.... 9 2. Le protéasome
... 10 B. Rôle de l’UPS dans la régulation du cycle cellulaire
.. 11 1. Généralités sur le cycle cellulaire
..
.... 11 2. Dégradations des facteurs impliqués dans la régulation du cycle cellulaire
. 11 C. Les E3 ubiquitine ligases à domaine RING
.... 12 1. Les complexes APC
.
. 13 2. Les complexes CRULs
.
..
.
.. 13 2.1 Les complexes SCF
.. 14 2.2 Les complexes ECS
.. 14 2.3 Les complexes Cul3.
.
15 2.4
Les complexes Cul4A/4B
..
15 3. La protéine DCAF-1
.
. 16 D. Détournement du système ubiquitine-protéasome par les virus : quelques exemples
.... 18 II. L’UTILISATION DES E3 UBIQUITINE LIGASES PAR LE VIH-1
.. 20 A. VIH-1
.
.
20 1. La maladie : le SIDA
20 2. Les traitements anti-viraux
...
20 3. Classification...
..
21 4. Génome du VIH-1..
... 21 4.1 Gènes de structure
.
22 4.2 Gènes de régulation
..
22 4.3 Gènes « auxiliaires »
...
.. 23 5. Structure de la particule virale
... 23 6. Les cellules cibles
. 24 7. Le cycle réplicatif
.. 24 7.1 Phase précoce
.
... 24 7.2 Phase tardive
..
25 B. Détournement des complexes E3 ubiquitine ligases par les protéines « auxiliaires » du VIH-1..
..
26 1. Recrutement du complexe SCFβTrCP 26par Vpu
..
..
1.1 Dégradation du récepteur CD4
.
. 26 1.2 Inhibition de la dégradation des substrats de laβTrCP
.
28 1.3 Inactivation de la Tétherine
....... 28 2. Recrutement du complexe Cul5-Elongin-Roc1 par Vif : dégradation de APOBEC3G
29 III.LA PROTEINE VPR ET SA CAPACITÉ À ARRÊTER LE CYCLE CELLULAIRE EN PHASE G2
29 B. La protéine Vpr
... 29 1. Généralités
. 29 2. Structure et localisation
. 30 3. Activités de Vpr au cours du cycle viral
... 30 4. Activité « arrêt G2 » de Vpr
.. 31 4.1 Rappel sur la transition G2/M du cycle cellulaire
31 4.2 Blocage du cycle cellulaire en phase G2
.. 32 4.3 Données bibiographiques sur l’activité « arrêt G2 » de Vpr
. 32 4.3.1 Effets observés sur l’activité transcriptionnelle virale
. 33 4.3.2 Vpr et les voies de régulation du cycle cellulaire
.... 33 a. Effets de Vpr sur l’activité de Wee1 et Cdc25
33 b. Vpr active la voie ATR
... 34 BIBLIOGRAPHIE
. 76 LISTE DES ABRÉVIATIONS
ADN Acide desoxiribonucléique ARN Acide ribonucléique ARNm ribonucléique messager Acide APC/C Anaphase promoting complex/cyclosome ATM Ataxia Telangiectasia Mutated ATP triphosphate Adénine ATR Ataxia Telangiectasia Related BCRA1 Breast cancer 1 bTrCP Beta Transducin repeat Containing Protein Cdk Kinase Cyclin-Dependent Chk1 Checkpoint1 Chk2 Checkpoint2 CMH I Complexe majeur d’histocompatibilité de classe I CMV Cytomegalovirus CKi Kinase inhibitors Cyclin-dependent CRULs Cullin Ring Ubiquitin Ligases Cul Culline DCAFs DDB1-Cul4A-associed Factor DDB1 Damage-DNA-binding protein DUB Deubiquitinating enzyme ECS cullin /SOCs Elongin/ FBW and WD repeat domain-containing F-box FBX and leucine-rich repeat proteinL F-box FBXO and others protein F-box HAART Highly anti-viral therapy HECT Homolog to the E6-AP carboxy terminus IN Intégrase LTR terminal repeat Long MA Matrice PIC de préintégration Complexe HPV Papillomavirus pRb protein Rétinoblastome Rev of expression of viral proteins Regulation RING Really interesting new gene RRE responsive element Rev RT inverse Transcriptase SCF SKP1-Cullin-F-box-protein SOCs Suppressor of cytokine signaling
SV5 Simian virus type 5 SWI/SNF2 Swiching/sucrose non fermating TAR Ttransactivation response element Tat Transactivator of transcription UPS Ubiquitine-protéasome VIH Virus de l’immunodéficience humaine XPE Xeroderma pigmentosum complementation group E AVANT-PROPOS Les virus sont des parasites intracellulaires stricts. Pour se répliquer et se disséminer, les virus ont acquis des stratégies efficaces afin d’exploiter à leur profit les divers processus cellulaires, comme le système-ubiquitine protéasome. Chez les eucaryotes, le système ubiquitine-protéasome constitue la principale machinerie protéolytique intracellulaire non lysosomale. La destruction sélective des protéines par ce système est assurée par deux événements successifs . Une première étape d’ubiquitinylation est mise en place par l’action de plusieurs enzymes appelées E1, E2 et E3 et qui consiste à marquer, par des molécules d’ubiquitine, les protéines destinées à être dégradées. La seconde étape est l’attaque protéolytique, des protéines poly-ubiquitinylées, par le protéasome 26S, un complexe protéase ATP-dépendant de 2,5 MDa. Les enzymes E3 ubiquitine ligases sont les acteurs essentiels de cette réaction car elles sont responsables de la reconnaissance spécifique des substrats destinées à être dégradés.Le système-ubiquitine protéasome joue un rôle majeur dans le contrôle du cycle cellulaire, en participant à la dégradation chronologique et ordonnée des protéines impliquées dans la régulation du cycle cellulaire. De nombreux virus ont su détourner à leurs avantages la machinerie du système ubiquitine-protéasome afin de protéger de la dégradation leurs protéines virales ou alors provoquer la dégradation des protéines cellulaires qui pourraient leur être nuisible. C’est le cas du VIH-1, qui a travers les fonctions de ces protéines « auxiliaires » comme Vif et Vpu, est capable d’interférer avec le système ubiquitine-protéasome afin de cibler des protéines cellulaires, comme le facteur de restriction APOBEC3G et le récepteur CD4, vers la dégradation protéasomale. Le VIH-1 présente également la particularité de pouvoir infecter les cellules en division et les cellules en quiescence. La capacité du VIH-1 à moduler le cycle cellulaire est associée à l’activité de la protéine « auxiliaire » Vpr. En effet, Vpr possède la propriété d’arrêter les cellules en fin de phase G2 du cycle cellulaire. Nous nous sommes donc intéressés à la capacité du VIH-1 à perturber la progression du cycle cellulaire, afin de comprendre comment et pourquoi le virus tire profit du cycle cellulaire de la cellule hôte, et permettre ainsi de découvrir de nouveaux mécanismes impliqués dans la progression du cycle cellulaire. La capacité du VIH-1 à détourner le système ubquitine-protéasome et certaines données de la
littérature rapportant des interactions entre Vpr et les complexes E3 ubiquitine ligases, appartenant à la famille dit « CRUL » (Cullin-RING-Ubiquitin-Ligase,) notamment avec le complexe E3 Cul4A-DDB1, nous ont conduis à envisager l’hypothèse que les complexes E3 ubiquitine ligases pouvaient participer à l’activité de Vpr, notamment dans son activité d’arrêt en phase G2 du cycle cellulaire. Des nouvelles données bibliographiques, concernant la découverte d’une nouvelle famille de protéines appelée « DCAFs » (DDB1-Cul4A-Associated-Factor-protein), des protéines associées au complexe E3 Cul4A-DDB1, nous ont confortés dans notre hypothèse. En effet, parmi les membres de cette famille, la protéine DCAF-1 a été auparavant identifiée comme étant un partenaire cellulaire de Vpr. Ainsi, mon travail a consisté à déterminer et caractériser le rôle de l’interaction entre Vpr et la protéine cellulaire DCAF-1 dans l’activité arrêt en phase G2 du cycle cellulaire de Vpr. INTRODUCTION I. LE SYSTÈME UBIQUITINE-PROTÉASOME Le système ubiquitine-protéasome (UPS) représente la principale machinerie de dégradation non lysosomale des protéines cellulaires et joue un rôle central dans la régulation d’évènements cellulaires essentiels tels que le cycle cellulaire, la présentation d’antigènes par le complexe majeur d’histocompatibilité de classe I (CMH I), la transcription et la transduction de signaux. Dans ce système, les complexes E3 ubiquitine ligases jouent un rôle prédominant dans le mécanisme d’ubiquitinylation des protéines qui précède leur dégradation par le protéasome. Elles assurent la spécificité de reconnaissance des substrats destinés à être dégradés. Le rôle crucial joué par les E3 ubiquitine ligases, font d’elles une cible de choix pour de nombreux virus. A. Le système ubiquitine-protéasome 1. L’ubiquitinylation des protéines cellulaires La destruction sélective des protéines par le système ubiquitine-protéasome est assurée par deux événements successifs. Le premier est le marquage des protéines destinées à être dégradées par la liaison covalente d’une chaîne poly-ubiquitine. Le second événement est l’attaque protéolytique des protéines poly-ubiquitinylées par le protéasome 26S. Le substrat est dégradé par le protéasome en petits peptides de 7-9 acides aminés, tandis que les molécules d’ubiquitine sont recyclées. La dégradation par le protéasome 26S des protéines ubiquitinylées peut intervenir dans le cytoplasme et le noyau. 1.1 Assemblage de la chaîne d’ubiquitine L’ubiquitine est une protéine de 8 kDa constituée de 76 acides aminés. L’ubiquitine se lie de façon covalente aux protéines cibles par l’intermédiaire de résidus lysine et nécessite des étapes successives impliquant l’activité de plusieurs enzymes spécifiques (1). La liaison covalente entre
l’ubiquitine et le substrat nécessite la fixation du groupement carboxyle du résidu glycine (G76) de l’ubiquitine à la fonction amine NH2 du résidu lysine du substrat à ubiquitinyler. Il peut se fixer sur le substrat protéique une seule molécule d’ubiquitine, c’est la mono-ubiquitinylation, ou bien plusieurs molécules formant une chaîne, on parle alors de poly-ubiquitinylation. Dans le cas de la poly-ubiquitinylation, la formation de chaînes d’ubiquitine s’effectue entre une lysine de la molécule d’ubiquitine et l’extrémité carboxy-terminale de la suivante. L’ubiquitine contient sept résidus lysines (K6, K11, K29, K27, K33, K48 et K63). Seules les lysines K6, K29, K48 et K63 sont impliquées dans la formation de chaînes de poly-ubiquitine. La modification des protéines par mono-ubiquitinylation ou poly-ubiquitinylation change leur fonction. La mono-ubiquitinylation est impliquée dans la régulation du transport intracellulaire des protéines en agissant comme un signal de tri dans la voie d’endocytose (2). Pour la poly-ubiquitinylation, la fixation d’un polymère d’au moins quatre molécules d’ubiquitine est nécessaire pour le ciblage du substrat protéique vers la dégradation par le protéasome 26S. Pour engager un signal de dégradation, la chaîne de poly-ubiquitine doit être située sur les résidus lysine 48 et 29. Alors que, la chaîne de poly-ubiquitine K63 participe aux évènements cellulaires tels que, l’initiation de la réponse inflammatoire, la fonction des ribosomesin vitroetin vivo, et la réparation de l’ADN (3). La dissociation des polymères d’ubiquitine est catalysée par des enzymes de déubiquitinylation, générant des molécules d’ubiquitine libre (4). 1.2 Cascade enzymatique La dégradation par le protéasome 26S nécessite le « marquage » des substrats par une chaîne de poly-ubiquitine. Une série de réactions enzymatiques est nécessaire à l’établissement de cette chaîne poly-ubiquitine. La réaction débute par l’activation, en présence d’ATP, de l’ubiquitine par une enzyme activatrice appelée E1. L’ubiquitine activée est ensuite transférée à une enzyme de conjugaison E2 qui établi une liaison thioester avec l’ubiquitine (5,6). Par la suite, l’enzyme E2 recrute une enzyme E3 appelée ubiquitine ligase qui interagit directement avec le substrat et transfère la molécule d’ubiquitine sur celui-ci. Enfin, un dernier type d’enzyme, appelé E4, pourrait jouer un rôle dans l’élongation de certaines chaînes d’ubiquitine (7). Chez l’homme, il n’existe que deux enzymes E1 et une trentaine d’enzymes E2. Par contre, compte tenu de la diversité des substrats, il existe une grande variété d’E3 ubiquitine ligases. Actuellement, on dénombre entre 500 et 1000 enzymes E3 ligases différentes chez l’homme. On distingue principalement deux grandes classes d’E3 ubiquitine ligases : les E3 à domaine HECT (Homolog to the E6-AP carboxy terminus) et les E3 à domaines RING (« really interesting new gene ») (8-10). Les E3 ligases à domaine U et à domaine PHD (plant homeodomain) sont relativement proches des E3 à domaine RING, mais n’entrent pas dans cette classification. Je ne développerai pas de paragraphe sur ces deux derniers types d’E3. 2. Le protéasome dans les cellules eucaryotes. Le terme courantPlusieurs formes de protéasomes sont présentes
du protéasome caractérise le protéasome 26S. Le protéasome 26S est un complexe protéase ATP dépendant de 2,5MDa qui assure la dégradation de protéines poly-ubiquitinylées en hydrolysant l’ATP. Il est constitué d’un core catalytique : le protéasome 20S et de deux sous-unités régulatrices : les complexes 19S et 11S. Dans la cellule, on retrouve toutes les combinaisons possibles de protéasome, le cœur 20S seul, associé à deux complexes 19S ou à deux complexes 11S ou bien encore associé à un seul complexe 19S et un seul complexe 11S. B. Rôle de l’UPS dans la régulation du cycle cellulaire 1. Généralités sur le cycle cellulaire Le cycle cellulaire est le processus fondamental par lequel une cellule-mère se divise pour générer deux cellules-filles identiques entre elles et à la cellule dont elles dérivent. Ce processus comprend deux phases majeures : l’interphase et la mitose. L’ensemble est classiquement divisé en quatre phases : G1, S, G2 et M. Les phases G1 et G2, sont des phases de jonction (« Gap ») qui précèdent respectivement la phase S (« Synthesis » ou synthèse), durant laquelle l’ADN est répliqué, et la phase M (« Mitosis » ou mitose), au cours de laquelle les chromosomes dédoublés sont répartis dans les deux cellules-filles. Le déclenchement, le contrôle et la succession des différentes étapes du cycle cellulaire sont coordonnés par une famille de protéines kinases, les kinases cyclines-dépendantes (CDKs). L’activation des CDKs est contrôlée par des évènements de phosphorylation, de déphosphorylation et par leur association à des protéines dites cyclines. Il existerait 13 CDKs et 25 cyclines (pour revue oncologie 2003). Les régulateurs négatifs des CDKs sont les inhibiteurs CKI (cyclin-dependent kinase inhibitors) appartenant à la famille INKA (p16, p15, p18 et p19), et à la famille Cip/Kip (p27, p21 et p57) (11). 2. Dégradation des facteurs impliqués dans la régulation du cycle cellulaire La progression du cycle cellulaire est finement régulée par des étapes de phosphorylation/déphosphorylation, mais également des étapes de dégradation orchestrées par le système ubiquitine-protéasome. Les études génétiques et biochimiques, réalisées principalement sur le bourgeonnement de la levure, ont permis d’identifier et de caractériser deux complexes E3 ubiquitine ligases majeures qui interviennent dans la régulation du cycle cellulaire : les complexes SCF (SKP1-Culline1-F-box-protein) (12) et les complexes APC/C (Anaphase-Promoting Complexe/Cyclosome) (13). Ces complexes sont actifs à des moments différents du cycle cellulaire, mais agissent de concert pour réguler leur propre activité. En effet, les complexes APC/C, actifs du début de la mitose jusqu’à la phase G1, induisent, entre autre, la dégradation de la cycline A, de la sécurine et de la cycline B (14,15). Les complexes de type SCF sont, quant à eux, actifs de la fin de la phase G1 jusqu’au début de la mitose. Parmi les complexes SCF, on peut citer le complexe SCFSKP2qui cible des régulateurs négatifs du cycle tels que p27, p21, et p57, permettant ainsi la progression du cycle cellulaire en phase S et G2. Le complexe SCFFBW7lui, induit la dégradation de régulateurs positifs duquant à cycle tels
que Myc, Jun, Cycline E et Notch. On peut encore citer la dégradation des protéines, Emi 1, Cdc25 (16) et Wee1 (17) par le complexe SCFβTrCP. La dégradation de la protéine Emi 1 intervient en début de mitose juste après la rupture de l’enveloppe nucléaire (18). Un défaut de la dégradation de la protéine Emi1 se traduit par un arrêt de la division des cellules qui ne peuvent plus progresser en mitose. La kinase Wee1 et les phosphatases Cdc25 régulent l’activité CDK (Cyclin-Dependant-Kinases) (19,20). C. Les E3 ubiquitine ligases à domaine RING Les E3 ubiquitine ligases à domaine RING (« Really Intersting New Gene ») catalysent le transfert de l’ubiquitine sans formation intermédiaire de liaison thioester (21). Le domaine RING est composé de 70 acides aminés et comprend une série d’histidines et de cystéines, avec des espacements caractéristiques qui permettent la fixation de deux ions zinc (8,21-23), Les E3 ubiquitine ligases à domaine RING peuvent être sous forme monomérique ou multimérique. Les E3 ubiquitine ligases monomériques portent à la fois le motif RING et un motif d’interaction avec les substrats. Dans le cas des complexes multimériques, le domaine de liaison à l’E2 et la reconnaissance du substrat sont portés par des sous-unités distinctes. C’est le cas des complexes APC/C et des complexes dit CRULs (Cullin RING Ubiquitin Ligase). ligasesCes deux familles d’E3 ubiquitine présentent de grandes similitudes architecturales et fonctionnelles. Elles sont constituées d’un core catalytique invariable comprenant une protéine à domaine RING (Roc1/Rbx1/Hrt1 dans le cas des CRULs et Apc11 dans le cas de APC) et un membre de la famille des cullines (ou apparentée à la famille des cullines dans le cas des complexes APC). Chez les Eucaryotes supérieurs, 7 cullines ont été identifiées, Cul-1, Cul-2, Cul-3, Cul-4A, Cul4B, Cul5 et Cul-7; Apc2 est une protéine apparentée aux cullines. 1. Les complexes APC auxcomplexes APC/C sont constitués d’éléments invariables : une protéine homologueLes cullines, Apc2 et une protéine à domaine RING, Apc11 (24). Ces complexes interagissent transitoirement avec au moins deux types d’adaptateurs, CDC20 (Cell Division Cycle 20) et CDH1. CDC20 et CDH1 assurent le recrutement des protéines contenant la boîte de destruction (D-Box) ou la boîte KEN (KEN box) (25). 2. Les complexes CRULs Au sein des complexes CRULs, les protéines portant le domaine RING sont des petites protéines dont la seule fonction connue est de relier l’enzyme E2 au reste du complexe E3. Les cullines comportent deux domaines qui leur permettent d’assurer la cohésion des différents composants des complexes CRULs. Un domaine globulaire CH (Cullin Homology) responsable de l’interaction entre la culline et la protéine RING, et un domaine « répétition culline » qui permet la liaison avec un autre élément du complexe CRUL : une protéine dite adaptatrice, qui diffère selon le complexe CRUL considéré. Cette protéine adaptatrice s’associe à des sous-unités adaptatrices
responsables de la reconnaissance spécifique du substrat, grâce à des régions d’interaction protéine-protéine. On dénombre aujourd’hui, quatre modèles de complexes CRULs: le complexe SCF composé de la protéine adaptatrice SKP1 et des sous-unités adaptatrices à motif « F-box », les complexes ECS composés des protéines adaptatrices, élongines B/C et de leurs sous-unités adaptatrices à motif « Socs-box », les complexes Cul3 associés aux protéines à motif BTB-box, et enfin les complexes Cul4 constitués de la protéine adaptatrice DDB1 et des sous-unités adaptatrices associées, les protéines de la famille DCAFs (DDB1 and Cul4A Associated Factors). 2.1. Les complexes SCF Il a été initialement montré que chez la levureS. cerevisiae, le complexe SCF permet l’entrée en phase S et ceci par la dégradation du facteur Sic1, l’inhibiteur du complexe cycline/CDK (26).Le complexe SCF (SKP1-Cullin1-Fbox), prototype des complexes de la famille CRULs est constitué de la culline 1, la protéine RING Roc 1 et de la protéine adaptatrice SKP1 (27). SKP1 s’associe à des sous-unités adaptatrices, type protéine à boîte F, responsables de la reconnaissance du substrat. Près de 70 protéines à boîtes F ont été identifiées chez l’homme et classées en trois catégories suivant la nature des motifs impliqués dans l’interaction avec les substrats (28).Les protéines à boîtes F, de type FBXW présentent un motif de type WD40 répété, les FBXL ont des motifs répétés en leucine et les FBXO ne portent pas de domaines caractéristiques. Toutes interagissent avec différents substrats et déterminent ainsi la spécificité du complexe SCF. Au sein des complexes SCF (les complexes SCFSKP2, SCFFBW7, SCFbTrCP), les protéines à boîte F SKP2, FBW7 et bTrCP ont été impliquées dans le contrôle du cycle cellulaire. 2.2. Les complexes ECS Dans les complexes ECS (Elongin/ Cullin /SOCs), la protéine RING Roc1 peut être associée soit à la culline 2 soit à la culline 5 et aux protéines adaptatrices élongine B et C. Comme pour la protéine SKP1 des complexes de type SCF, les protéines élongines ciblent les substrats par l’intermédiaire d’une sous-unité adaptatrice, constituée d’un motif d’interaction au substrat particulier, appelé « boîte SOCs » (Suppressor of Cytokine Signaling). Ce motif a été initialement identifié dans la régulation négative de la signalisation intracellulaire induite par les cytokines. De la même façon que les protéines à boîte F, les protéines de type SOCS reconnaissent spécifiquement le substrat (29,30).Le premier complexe ECS caractérisé fut le complexe contenant la protéine adaptatrice nommée « supresseur de tumeur » (VHL) permettant l’ubiquitinylation et la dégradation du facteur de transcription HIF1a (31). 2.3. Les complexes à Cul3 Les études du groupe de Wade Harper et Matthias Peter ont montré que les complexes CRULs assemblés par la Cul3, sont associés à une protéine adaptatrice à domaine BTB « BTB box » (broad complex, tramtrack and bric-a-brac) (32,33).Treize protéines à motif BTB ont été identifiées par des
expériences de double hybride chez la levure en utilisant la protéine humaine Cul3 comme appât (34). Contrairement à SKP1 et Elongine C/B, les protéines à motif BTB sont capables, de relier directement le substrat à la machinerie de dégradation. 2.4. Les complexes Cul4A/4B Il existe deux types de culline 4, la Cul4A et la Cul4B.La protéine adaptatrice associée aux cullines 4 est la protéine DDB1 (Damage-specific DNA Binding protein 1) (35).DDB1 est une protéine de 127 kDa avec une structure à multi-domaines comportant trois domaines en forme d’hélice à 7 pales (« beta propellers » ; BPA, BPB et BPC). La protéine DDB1 a été initialement caractérisée par ses fonctions dans la réparation des dommages à l’ADN induits par les rayonnements UV (36). Son association avec la protéine DDB2, permet la reconnaissance des lésions induites sur l’ADN par le rayonnement UV ou des agents chimiques. La fonction significative du complexe Cul4A-DDB1 a été soulignée par la découverte de l'interaction de la protéine V du virus SV5 avec DDB1 (37,38). Cette interaction permet à la protéine V de détourner le complexe E3 Cul4A-DDB1-ROC1 afin d’accélérer la dégradation de STAT1, et ainsi de bloquer la réponse antivirale de la cellule hôte. D’autre part, il a été montré que DDB1 est impliquée dans d’autres processus fondamentaux tels que la transcription, la mort cellulaire, le développement embryonnaire et le cycle cellulaire (39). Bien que, sa structure en multi-domaines pourrait permettre à DDB1 de recruter directement le substrat pour le connecter à la machinerie d’ubiquitinylation, l’ubiquitinylation de plusieurs substrats par le complexe E3 Cul4-DDB1 nécessite l’intervention d’un facteur cellulaire supplémentaire. Trois protéines ont été associées à DDB1: les protéines DDB2, CSA et Det1-Cop1. L’association de DDB2 à DDB1 permet au complexe E3 ROC1-Cul4-DDB1 de cibler les protéines histones H2A (40),H3 et H4 (41), ainsi que le facteur de réparation XPC, vers la dégradation par le protéasome (42). L’interaction de DDB1 avec la protéine CSA (Cockayne syndrome group A) induit la dégradation de CBS (Cystathionine beta-synthase), une enzyme de la famille SWI/SNF2 qui est impliquée dans le remodelage de la chromatine. Enfin, la liaison de DDB1 avec la protéine Det1-Cop1 conduit à l’ubiquitinylation du facteur de transcription c-Jun dans les cellules de mammifères (43). Les analyses protéomiques dédiées à la recherche de substrats potentiels du complexe Cul4A-DDB1, réalisées en utilisant comme appât soit Cul4A soit DDB1, ont permis d’identifier plus de 30 protéines associées au complexes E3 Cul4-DDB1-ROC1 (44-46). L’analyse prédictive de ces protéines révèle que 16 d’entre elles, dont DDB2 et CSA présentent un motif WD40 répété. Ces protéines ont été appelées « DCAFs » car elles interagissent à la fois avec DDB1 et Cul4A, et sont aujourd’hui représentées comme une nouvelle famille de protéines servant au recrutement des substrats destinés à la dégradation médiée par le complexe constitué de la Culline 4 (44). Au sein de cette nouvelle famille de protéines « DCAFs », nous nous sommes particulièrement interessé à la protéine nommée DCAF-1. 3. La protéine DCAF-1 DCAF-1, en premier lieu appelée RIP «Vpr Interacting Protein ou encore VprBP « »Vpr Binding Protein a été initialement identifiée, par des expériences » co-immunoprécipitation, de
