MINISTERE DE L'EDUCATION NATIONALE
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Niveau: Supérieur
MINISTERE DE L'EDUCATION NATIONALE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE Présenté par CARTRON Pierre-François Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes Soutenu le 12 octobre 2001 devant le jury suivant : Monsieur Andràs PALDIS Président Madame Flore RENAUD-PAÏTRA Rapporteur Monsieur Bernard MIGNOTTE Examinateur Monsieur Stephen MANON Examinateur Monsieur François VALLETTE Examinateur Laboratoire de génétique moléculaire et physiologique Directeur : Bernard MIGNOTTE E.P.H.E (Science de la Vie et de la Terre) Laboratoire INSERM U419 Directeur : Khaled MEFLAH Institut de Biologie, CHU de Nantes Directeur de stage :François M.VALLETTE Résumé De nombreuses études ont été entreprises afin d'évaluer la valeur pronostique des protéines anti- Interaction structure-fonction de la protéine pro-apoptotique Bax au sein de glioblastomes multiformes. EPHE Banque de Monographies SVT 1
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MINISTERE DE L'EDUCATION NATIONALE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE Présenté par CARTRON Pierre-François Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes Soutenu le 12 octobre 2001 devant le jury suivant : Monsieur Andràs PALDIS Président Madame Flore RENAUD-PAÏTRA Rapporteur Monsieur Bernard MIGNOTTE Examinateur Monsieur Stephen MANON Examinateur Monsieur François VALLETTE Examinateur Laboratoire de génétique moléculaire et physiologique Directeur : Bernard MIGNOTTE E.P.H.E (Science de la Vie et de la Terre) Laboratoire INSERM U419 Directeur : Khaled MEFLAH Institut de Biologie, CHU de Nantes Directeur de stage :François M.VALLETTE Résumé De nombreuses études ont été entreprises afin d'évaluer la valeur pronostique des protéines anti- Interaction structure-fonction de la protéine pro-apoptotique Bax au sein de glioblastomes multiformes. EPHE Banque de Monographies SVT 1
- populations cellulaires des eucaryotes supérieurs
- régulation de l'activité caspase
- cellule
- gbm
- vertébrés supérieurs
- gène
- part des maladies auto-immunes
- prolifération cellulaire
- maladies neurodégénératives
- apoptose
MINISTERE DE L’EDUCATION NATIONALE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE Présenté par CARTRON Pierre-François Pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes BaxInteraction structure-fonction de la protéine pro-apoptotique au sein de l tomes multiformes. g ioblas Soutenu le 12 octobre 2001 devant le jury suivant :
Monsieur Andràs PALDIS Président Madame Flore RENAUD-PAÏTRA Rapporteur Monsieur Bernard MIGNOTTE Examinateur Monsieur Stephen MANON Examinateur Monsieur François VALLETTE Examinateur
Laboratoire de génétique moléculaire et physiologique Directeur : Bernard MIGNOTTE E.P.H.E (Science de la Vie et de la Terre) bmignotte@genetique.usqv.fr Laboratoire INSERM U419 Directeur : Khaled MEFLAH Institut de Biologie, CHU de Nantes Directeur de stage :François M.VALLETTE allefvtnan@ettresni.sefrm. Résumé De nombreuses études ont été entreprises afin d’évaluer la valeur pronostique des protéines anti-
apoptotiques (Bcl-2, Bcl-xl, mcl-1) et pro-apoptotiques (Bax et Bak) dans un grand nombre de cancers. Nous avons dans un premier temps montré dans une série de glioblastomes multiformes humains (GBM) analysée par immunoblot qu’une élévation de la quantité de Bcl-2 était associée de façon parallèle à celle de Bax, le niveau de Bcl-xl demeurant constant. Ceci suggère l’existence d’une possible co-régulation entre les protéines Bcl-2 et Bax. De plus, cette étude a montré l’existence de 3 sous populations de GBM : une première qui exprimant la forme sauvage de Bax soit Bax a, une seconde qui exprime l’isoforme Bax y et une troisième qui n'exprime pas Bax. L’étude des BdGBM (environ 4% des GBM) montre que l’absence de la protéine Bax est due à une totale méthylation du gène de Bax. Des cultures primaires de BdGBM établies à partir de tumeurs solides, sont résistantes à l’induction de l’apoptose que ce soit par une drogue chimiothérapeutique comme la doxorubicine, par un inducteur naturel de l’apoptose comme Fas ligand ou encore par un inhibiteur de protéine kinase tel que la staurosporine. Cependant, la transfection d’un transgène Bax dans ces cellules BdGBM est capable de restaurer une activité apoptotique comparable à celle des cellules BeGBM. De plus, les tumeurs comme les cellules BdGBM se caractérisent par une surexpression de la protéine pro-apoptotique Bak alors que l’expression d’autres protéines de la famille Bcl-2 n’est pas modifiée. Ainsi, il semble que la déficience en Bax soit partiellement compensée par une autre voie pro-apoptotiquein vivola voie Bak, ou par l’additionin vitrode Bax exogène. Les GBM Bax y (environ 22% des GBM) se caractérisent par l’expression d’une protéine Bax de 19 kD tronquée en son extrémité N-terminale, et issue d’un ARNm délété partiellement de l’exon 1, lui-même produit d’une méthylation existant entre la TATA box et l’ATG en position 58 du gène de Bax. L’expression de Bax y est associée une diminution de la proliférationin vivodes GBM, et est corrélée à une survie plus longue des patients porteurs de cette isoforme. De plus, la xénogreffe chez la souris Nude et la clonogénicité de cultures primaires de GBM Bax y est plus lente que celle de GBM Bax a. Il semble donc que l’expression de Bax ylimite la progression tumorale de GBM et soit donc bénéfique en terme de survie pour le patient. L’analyse fonctionnelle de Bax y révèle que cette isoforme, équivalente à Bax DART, est plus apoptogénique que Bax a de part une meilleure association avec la mitochondrie. Ainsi, une série de mutations au sein de différentes structures de Bax (extrémité N et C terminale et hélicesa5a6) montre le rôle essentiel tenu par une proline situé dans l’extrémité N-terminale de Bax quant à la localisation mitochondriale de Bax et sa fonction apoptogénique. De plus, ces résultats suggèrent que le changement de conformation de l’extrémité N-terminale de Bax dévoile une autre structure qui par interaction avec les hélices a5a6facilite l’association de Bax à la mitochondrie. Mots clés : Bax a, Bax y, Apoptose, glioblastomes multiformes, cellules Bax déficientes, mitochondrie. Sommaire _____________________________________________________________ A Introduction. 1 1. Physio-pathologie de la mort cellulaire.______________________________________ 1 1.1. Généralités. 1 _________________________________________________________ 1.2. Apoptose, développement et prolifération cellulaire.______________________ 1 1.2.1. Apoptose et développ ment ______________________________________________________ e . 1 1.2.2. Apoptose et prolifération cellulaire._________________________________________________ 2
1.3. Apoptose et pathologies autres que le cancer._____ 2 _______________________ 1.3.1. Apoptose et maladies neurodégénératives.____________________________________________ 2 1.3.2. Apoptose et SIDA._________________________________________ 3 ____________________ 1.3.3. Apoptose et maladies auto-immunes. 3 _______________________________________________ 1.4. Apoptose et cancérogenèse.____________________________________________ 3 1.4.1. Cancérogenèse._________________________________________________________________ 3 1.4.2. p53 et cancer. ___________________________________________________________ 4 _______ 2. Apoptose. ___________ 5 ____________________________________________________ 2.1. Nécrose et app__________________________________________________ o tose. 5 2.2. Apoptose et sénescence._______________________________________________ 6 2.3. Apoptose : de C.elega aux mammifères._______________________________ ns 7 2.4. Les récepteurs de mort.____ ___________ 8 ________________________________ 2.4.1. Récepteurs et ligands.___________________________________________________________ 8 2.4.2. Voie Fas ou CD95 ou TRAIL/APO-2L. 9 _____________________________________________ 2.5. Famille Bcl-2. 10 ______________________________________________________ _________________________________________________ 2.5.1. Les membres de la famille Bcl-2. 11 2.5.2. Dimérisation. 12 _________________________________________________________________ 2.5.3. La phosphorylation.____________________________________________________________ 13 2.5.4. Invalidités géné q __________________________________________________________ ti ues. 14 2.6. La mitochondrie, cytochrome c et AIF. 15 __________________________________ 2.6.1. mitocho cy ____________________________________________________ ndrie et tochrome c. 15 ___________________________________________________________ 2.6.2. Mitochondrie et AIF. 16 2.7. pases._______________________________________________________ Les cas 17 2.7.1. Structure. 17 ____________________________________________________________________ ___________________________________________________________ 2.7.2. Activité et substrats. 17 2.7.3. Régulation de l’activité caspase. ________________________________ 19 ________________ __ 2.8. Ap f-1 et l’apoptosome.______________________________________________ a 22 pïn______________________________________________________ 2.9. Les cal a es. 23 A propos de Bax.________________________________________________________ 3. 24 3.1. Structure. 24 __________________________________________________________ _________________________________________________________ 3.2. Isoformes. 24 3.3. Bax, oligomérisation et mitochondrie._ 26 ________________________________ 3.4. Bax et cancérologie. ________________________________________________ 27 _ log ____________________________________________ 28 4. Bio ie des tumeurs cérébrales. 4.1. Généralités. 28 ________________________________________________________ 4.2. Epidémiologie et “ grading . 28 _________________________________________ 4.3. Biologie des gliomes. 29 ________________________________________________ 4.3.1. Généralités. 29 ___________________________________________________________________ 4.3.2. Progression tumorale.__________________________________________________________ 30 5. Objectifs des recherches effectuées.____ ______ 34 ________________________________ Abréviations ADN : acide désoxyribonucléique ADNc : ADN complémentaire ADNg : ADNg genomique
ARN : acide ribonucléique. ARNm : acide ribonucléique messager APC : Ademadous Polyposis Coli ART :apoptosis regulation of targeting ATP : adénosine triphosphate BdGBM : glioblastome multiforme Bax déficient BeGBM : glioblastome multiforme Bax exprimé CARD : caspase recuitment domain DED death effector domain Doxo : doxorubicine EGF : epidermal growth factor FADD : Fas-associated death domain containing protein GBM : glioblastome multiforme IAP : inhibitor of apoptosis kD : kilodalton Mito : mitochondrie MSP : méthylation spécifique PCR pb : paire de base PCR : réaction de polymérisation en chaîne REGF : récepteur au facteur de croissance epidermique : transcription reverse RT SMART : STS : staurosporine TNF : tumor necrosis factor UFC : unité formant colonie A Introduction.
1. Physio-pathologie de la mort cellulaire. 1.1. Généralités. La mort cellulaire programmée est un processus physiologique normal régulant à la fois quantitativement et qualitativement les populations cellulaires des eucaryotes supérieurs tant au niveau du développement embryonnaire qu’à celui de l’homéostasie tissulaire. Ce phénomène d’élimination des cellules "surnuméraires" ou potentiellement dangereuses est médié par un processus planifié appelé apoptose. En 1842, Vogt (Vogt 1842) décrit pour la première fois un phénomène de mort physiologique. Ensuite, il faudra attendre 1965 et les travaux de Lockshin et Williams (Lockshin et Williams 1965) pour associer le concept de mort cellulaire programmée à celui du développement. Puis en 1972, Kerr et Wyllie (Kerr et Wyllie 1972) définissent les bases morphologiques et biochimiques d’un type de mort cellulaire programmée, qu’ils nomment apoptose. A partir de 1982, l’étude du nématodeC.elegans génétique de révèle l’existence d’un programme mort cellulaire programmée (Hengartner et Horvitz 1994), ce qui montre que l’apoptose est un processus actif, complexe et hautement régulé tout comme la différenciation et la prolifération cellulaire. De ce fait, la dérégulation de l’apoptose est impliquée dans un grand nombre de situations physiopathologiques (Thompson 1995). Ainsi, si un excès de mort cellulaire par apoptose peut être
