MINISTERE DE L'EDUCATION NATIONALE
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Niveau: Supérieur
MINISTERE DE L'EDUCATION NATIONALE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE Présenté par Tiphaine GODEFROY Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes VARIABILITE GENETIQUE DU SYSTEME DE L'INTERLEUKINE- 18 ET IMPLICATION DANS L'ATHEROSCLEROSE Soutenu le 24 mai 2005 devant le jury suivant : Dr Stéphane RICHARD – Président Dr Susan SAINT-JUST – Rapporteur Dr Laurence TIRET– Examinateur Dr Christophe COMBADIERE – Examinateur Laboratoire de Biologie Moléculaire Directeur : Dr Andràs PALDI EPHE (Sciences de la Vie et de la Terre) INSERM U525 Directeur : Dr François CAMBIEN Génétique Epidémiologique et Moléculaire Resp.Scientifique : Dr Laurence TIRET des Pathologies Cardiovasculaires Faculté de médecine Pitié-Salpêtrière 91 boulevard de l'Hôpital 75634 Paris cedex 13 ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES VARIABILITE GENETIQUE DU SYSTEME DE L'INTERLEUKINE-18 ET IMPLICATION DANS L'ATHEROSCLEROSE Tiphaine GODEFROY Soutenu le 24 mai 2005 EPHE Banque de Monographies SVT 1
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MINISTERE DE L'EDUCATION NATIONALE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE Présenté par Tiphaine GODEFROY Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes VARIABILITE GENETIQUE DU SYSTEME DE L'INTERLEUKINE- 18 ET IMPLICATION DANS L'ATHEROSCLEROSE Soutenu le 24 mai 2005 devant le jury suivant : Dr Stéphane RICHARD – Président Dr Susan SAINT-JUST – Rapporteur Dr Laurence TIRET– Examinateur Dr Christophe COMBADIERE – Examinateur Laboratoire de Biologie Moléculaire Directeur : Dr Andràs PALDI EPHE (Sciences de la Vie et de la Terre) INSERM U525 Directeur : Dr François CAMBIEN Génétique Epidémiologique et Moléculaire Resp.Scientifique : Dr Laurence TIRET des Pathologies Cardiovasculaires Faculté de médecine Pitié-Salpêtrière 91 boulevard de l'Hôpital 75634 Paris cedex 13 ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES VARIABILITE GENETIQUE DU SYSTEME DE L'INTERLEUKINE-18 ET IMPLICATION DANS L'ATHEROSCLEROSE Tiphaine GODEFROY Soutenu le 24 mai 2005 EPHE Banque de Monographies SVT 1
- comparaison des approches de criblages par sscp
- polymorphismes en complète association
- il18
- gènes il18r1
- polymorphisme
- association des polymorphismes avec la mortalité cardiovasculaire durant le suivi ………………………………………………………………………
- moléculaire resp
- diminution de la mortalité cardiovasculaire
- criblage moléculaire
- approches thérapeutiques
MINISTERE DE L’EDUCATION NATIONALE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre
MEMOIRE Présenté par Tiphaine GODEFROY Pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes
VARIABILITE GENETIQUE DU SYSTEME DE L’INTERLEUKINE-18 ET IMPLICATION DANS L’ATHEROSCLEROSE
Soutenu le 24 mai 2005 devant le jury suivant :
Dr Stéphane RICHARD Président Dr Susan SAINT-JUST Rapporteur Dr Laurence TIRET Examinateur Dr Christophe COMBADIERE Examinateur
Laboratoire de Biologie Moléculaire : Dr Andràs PALDI Directeur EPHE (Sciences de la Vie et de la Terre) INSERM U525 : Dr François CAMBIEN Directeur Génétique Epidémiologique et Moléculaire Resp.Scientifique : Dr Laurence TIRET des Pathologies Cardiovasculaires Faculté de médecine Pitié-Salpêtrière 91 boulevard de l’Hôpital 75634 Paris cedex 13 ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES VARIABILITE GENETIQUE DU SYSTEME DE L’INTERLEUKINE-18 ET IMPLICATION DANS L’ATHEROSCLEROSE Tiphaine GODEFROY Soutenu le 24 mai 2005
L’athérosclérose est une maladie complexe résultant d'interactions entre facteurs génétiques et environnementaux. L'évolution de la maladie et la survenue de complications (infarctus du myocarde, principalement) s'accompagnent d'une inflammation chronique de la paroi artérielle, processus dans lequel de nombreuses cytokines pro-inflammatoires jouent un rôle important. L’objectif de ce travail a été d’étudier la variabilité de 5 gènes candidats du système de l’interleukine-18 (IL18), cytokine pro-inflammatoire suspectée d'avoir un rôle étiologique dans l'athérosclérose, et de tester leurs effets sur la mortalité cardiovasculaire et le taux circulant d' IL18. Les gènes étudiés sont les gènes codant pour l'IL18 elle-même (IL18), ses 2 récepteurs (IL18R1 et IL18RAP), son inhibiteur endogène (IL18BP) et l'enzyme de conversion Caspase-1 qui convertit IL18 en sa forme active (CASP1). PourIL18 etCASP1le criblage moléculaire pour la recherche de variants dans les régions, codantes et régulatrices a été réalisé respectivement sur 95 individus par la technique d’électrophorèse SSCP pourIL18, et sur 31 pools de deux individus par la technique de séquençage capillaire pour CASP1. Pour les gènesIL18R1,IL18RAPetIL18BP, les polymorphismes ont été choisis à partir des informations disponibles dans la base de données Innate-Immunity. Pour ces 5 gènes, les polymorphismes les plus pertinents ont été génotypés dans l’étude AtheroGenepar la technique du TaqMan. Cette étude, comprenant environ 1500 individus atteints de maladie coronarienne suivis prospectivement et 500 témoins, a pour objectif d'identifier les gènes contribuant au développement et aux complications de l’athérosclérose. Au total, 30 polymorphismes ont été identifiés par criblage moléculaire et 19 polymorphismes ont été sélectionnés à partir des informations disponibles dans la base de données Innate-Immunity. Après génotypage dans une étude intermédiaire SIPLAC dans le but d'écarter les polymorphismes redondants ou trop rares, 22 polymorphismes ont finalement été génotypés dans l’étude AtheroGene. Des analyses haplotypiques de ces gènes ont ensuite été réalisées. Pour le gèneIL18, l’allèle G du variantIL18et l’haplotype GCAGT sont associés à/A+183G une diminution significative du taux de la protéine. Ce même haplotype est associé à une diminution de la mortalité cardiovasculaire. Pour le gèneCASP1, le polymorphismeCASP1/G+7/in6A, qui fait partie d'un bloc de 14 polymorphismes en complète association, est associé à une différence cas/témoins, avec un effet protecteur de l’allèle A sur le risque cardiovasculaire. Ces résultats suggèrent qu' IL18 n’est pas un simple marqueur de l’athérosclérose mais a un rôle étiologique dans le développement de la maladie. Une approche thérapeutique basée sur son inhibition pourrait limiter la progression et les complications de la maladie. MOTS CLES :athérosclérose, gène candidat, polymorphisme génétique, PCR (Polymerase Chain Reaction), SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism), séquençage, TaqMan, études d’association. PLAN I. OBJECTIFS DU PROJET DE RECHERCHE
p.5 1. Problématique de recherche du laboratoire : stratégie gène candidat
p.5 2. Objectifs du projet de recherche
p.5 II. L’ATHEROSCLEROSE
. p.7 1. Définition
p.7 2. Structure de la paroi vasculaire normale et composition cellulaire
.... p.8 3. La plaque d'athérome
.. p.9 3.1. Les étapes de la formation de la plaque: l’athérogénèse 3.1.1. La lésion précoce athéroscléreuse 3.1.2. Le dysfonctionnement et l’activation endothéliale par les LDL : transport, pénétration et oxydation des LDL
INTRODUCTION
3.1.3. Recrutement des monocytes : formation de cellules spumeuses 3.1.4. Activation des cellules musculaires lisses 3.1.5. Le centre athéromateux et la fragilisation de la plaque 3.1.6. Ulcération de la plaque fibrolipidique 3.1.7. Les médiateurs pro-inflammatoires de l’immunité innée et acquise 3.1.8. facteurs favorisant les complications de l'athéroscléroseLes (ou facteurs aggravants) III. LE SYSTEME BIOLOGIQUE DE L’INTERLEUKINE-18
...
.. p.17 1. I1L7
18
.p.. 2. Les récepteurs d'IL18 : (IL18R1, IL18RAP)
.. p.19 2.1. Rôles et structure d'IL18R1 et IL18RAP 2.2. Régulation dans les cellules lymphoïdes, synergie avec IL12 et actions d'IL18 sans IL12 2.2.1. Régulation dans les lymphocytes T 2.2.2. Régulation dans les lymphocytes B : production d’IFNg et d’IgE 2.2.3. Régulation dans les cellules NK 2.2.4. Régulation dans les macrophages 2.3. La voie de signalisation des récepteurs d'IL18 2.4. Synergie d'IL18 avec IL12 pour l’induction d’IFNg 3. Le récepteur soluble IL18BP
. p.24 4. L’enzyme de conversion d'IL18 : La Caspase-1
.
... p.24 IV. IMPLICATION DU SYSTEME DE L’INTERLEUKINE-18 DANS L’ATHEROSCLEROSE
. p.26 V. GENES DU SYSTEME D’IL18
..
... p.28 1. IL18
p.28 1.1. Description du gène IL18 1.2. Les polymorphismes décrits dans le gène IL18 2. Les gènes IL18R1 et IL18RAP
p.29 2.1. Description des gènes IL18R1 et IL18RAP 2.2. Les polymorphismes décrits dans les gènes IL18R1 et IL18RAP 3. Le gène codant pour IL18BP
. p.30 3.1. Description du gène IL18BP 3.2. Les polymorphismes décrits dans le gène IL18BP 4. Le gène CASP1
.. p.30 4.1. Description du gène CASP1 4.2. Les polymorphismes décrits dans le gène CASP1 MATERIEL ET METHODES I. LES ETUDES SIPLAC ET ATHEROGENE
.
p.32 1. L’étude SIPLAC
... p.32 1.1. Description de l’étude 1.2. Variables recueillies 2. L’étude ATHEROGENE
..
p.33 2.1.Description de l’étude 2.2.Variables recueillies II. RECHERCHE DE VARIANTS GENETIQUES.
. p.36 1. Extraction d’ADN
. p.36 1.1. Récolte du sang et buffy coat
