MINISTERE DE L'EDUCATION NATIONALE
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Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8
MINISTERE DE L'EDUCATION NATIONALE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre THESE DE DOCTORAT Biologie cellulaire et moléculaire présentée par Samia ZIDANI-ZERTAL Soutenue le 8 février 2002 pour l'obtention du grade de DOCTEUR de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes DETERMINANTS GENETIQUES DE L'EXPRESSION D'HEMOGLOBINE FŒTALE Madame ANGELA RAGUSA Rapporteur Madame NICOLE FEINGOLD Rapporteur Monsieur BERNARD MIGNOTTE Président Monsieur ANDRAS PALDI Examinateur Monsieur RAJAGOPAL KRISHNAMOORTHY Examinateur Laboratoire de Biologie Moléculaire de l'EPHE Directeur: Dr Andràs. PALDI Institut JACQUES-MONOD CNRS, Universités paris 6 et 7 2 place Jussieu; Tour 43 75251 Parsi cedex 05 INSERM U 458 Pharmacogénétique et abords thérapeutiques des maladies héréditaires. Laboratoire Hémoglobinopathies. Directeur de thèse : Rajagopal Krishnamoorthy Hôpital Robert Debré 48 Boulevard Sérurier 75019 Paris Résumé La synthèse d'hémoglobine fœtale (HbF) diminue progressivement après la naissance pour ne représenter que moins de 0.4% au stade adulte. La présence de taux élevés d'HbF (>0.7%) chez l'adulte sain, caractérise les persistances héréditaires d'hémoglobine fœtale (PHHF). Ces PHHF sont génétiquement hétérogènes. EPHE Banque de Monographies SVT 1
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MINISTERE DE L'EDUCATION NATIONALE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre THESE DE DOCTORAT Biologie cellulaire et moléculaire présentée par Samia ZIDANI-ZERTAL Soutenue le 8 février 2002 pour l'obtention du grade de DOCTEUR de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes DETERMINANTS GENETIQUES DE L'EXPRESSION D'HEMOGLOBINE FŒTALE Madame ANGELA RAGUSA Rapporteur Madame NICOLE FEINGOLD Rapporteur Monsieur BERNARD MIGNOTTE Président Monsieur ANDRAS PALDI Examinateur Monsieur RAJAGOPAL KRISHNAMOORTHY Examinateur Laboratoire de Biologie Moléculaire de l'EPHE Directeur: Dr Andràs. PALDI Institut JACQUES-MONOD CNRS, Universités paris 6 et 7 2 place Jussieu; Tour 43 75251 Parsi cedex 05 INSERM U 458 Pharmacogénétique et abords thérapeutiques des maladies héréditaires. Laboratoire Hémoglobinopathies. Directeur de thèse : Rajagopal Krishnamoorthy Hôpital Robert Debré 48 Boulevard Sérurier 75019 Paris Résumé La synthèse d'hémoglobine fœtale (HbF) diminue progressivement après la naissance pour ne représenter que moins de 0.4% au stade adulte. La présence de taux élevés d'HbF (>0.7%) chez l'adulte sain, caractérise les persistances héréditaires d'hémoglobine fœtale (PHHF). Ces PHHF sont génétiquement hétérogènes. EPHE Banque de Monographies SVT 1
- adulte
- persistances héréditaires d'hémoglobine fœtale
- fixation d'o2
- biologie moléculaire
- vertébrés
- divergence entre hémoglobines animale
- gène
- hémoglobine
- adulte sain
MINISTERE DE L’EDUCATION NATIONALE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre THESE DE DOCTORAT Biologie cellulaire et moléculaire présentée par Samia ZIDANI-ZERTAL Soutenue le 8 février 2002 pour l’obtention du grade de DOCTEUR de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes
DETERMINANTS GENETIQUES DE L’EXPRESSION D’HEMOGLOBINE FTALE
Madame ANGELA RAGUSA Rapporteur Madame NICOLE FEINGOLD Rapporteur Monsieur BERNARD MIGNOTTE Président Monsieur ANDRAS PALDI Examinateur Monsieur RAJAGOPAL KRISHNAMOORTHY Examinateur Laboratoire de Biologie Moléculaire de l’EPHE Directeur: Institut JACQUES-MONODDr Andràs. PALDI CNRS, Universités paris 6 et 7 2 place Jussieu; Tour 43 75251 Parsi cedex 05 paldi@ijm.jussieu.fr
INSERM U 458 "Pharmacogénétique et abords thérapeutiques des maladies héréditaires". Laboratoire "Hémoglobinopathies". Directeur de thèse :Rajagopal Krishnamoorthy Robert Debré Hôpital 48 Boulevard Sérurier 75019 Paris krishna@infobiogen.fr
Résumé La synthèse d’hémoglobine fœtale (HbF) diminue progressivement après la naissance pour ne représenter que moins de 0.4% au stade adulte. La présence de taux élevés d’HbF (>0.7%) chez l’adulte sain, caractérise les persistances héréditaires d’hémoglobine fœtale (PHHF). Ces PHHF sont génétiquement hétérogènes.
Le but de notre étude est de contribuer à la définition de marqueurs génétiques de la variabilité d’expression d’HbF, susceptibles d’être des éléments de pronostic d’atténuation des hémoglobinopathies. Dans ce travail, par une étude génétique à la fois épidémiologique et familiale, nous décrivons quatre mécanismes différents contribuant à l’augmentation d’expression d’HbF chez l’adulte. * Chez quelques rares sujets dont le profil d’expression d’HbF est atypique, nous avons pu établir une corrélation directe avec le cluster beta globine et montré que le mode de transmission est strictement mendelien. En effet, nous avons identifié dans ce locus: - Une nouvelle mutation dans la boite distale CCAAT®CAAAT (en 114 du gène Gg)qui s'accompagne d'une surexpression du gène contigu. - Une nouvelle délétion de 7.4 kb qui supprime le gène structural d globine, la région intergénique db et le promoteur b globine créant ainsi un nouveau gène hybride db globine. * Chez tous les autres sujets, nous avons retrouvé une élévation modérée d’HbF (1 à 4% ; PHHF de type Suisse). Dans ce type de PHHF, le mode de transmission reste encore inconnu et l’expression d’HbF revêt un caractère quantitatif (trait quantitatif). Nos résultats suggèrent la contribution de marqueurs liés au locus beta globine ainsi qu’à la région 6q23.1 (chromosome 6). Discipline: Biologie moléculaire Mots-Clefs:Persistances héréditaires d’hémoglobine fœtale (PHHF) Chromosome 11- Locus beta globine - polymorphismes - mutations - chromosome 6 INTRODUCTION 1- L’hémoglobine 1-1- Notions d’évolution 1-2- Les hémoglobines humaines 1-3- Evolution ontogénique des hémoglobines humaines 2- Les gènes de globine 2-1- Localisation et organisation des gènes de globine 2-2- Structure des gènes de globine 2-3- Défauts moléculaires affectant l’expression des gènes de globine 3- Régulation de l’expression des gènes de globine
TABLE DES MATIERES
3-1-Séquences cis-régulatrices 3-1-1- Promoteurs 3-1-2- Enhancers et silencers 3-1-3- Le LCR b globine 3-1-3-1 Mise en évidence du LCRb 3-1-3-2- Propriétés du LCRb 3-1-3-3- Sites hypersensibles du LCRb: Caractéristiques et fonctions 3-2- Facteurs transcriptionnels 3-2-1- Facteurs érythroides 3-2-2- Facteurs ubiquitaires 4- Régulation de l’expression des gènes de globine au cours du développement 4-1- Extinction du gène e 4-2- Gènes get b 4-2-1-Séquences enciset facteurstransimpliquésdans la commutation HbF®HbA 4-2-1-1-Extinction des gènes g globine 4-2-1-2-Compétition entre gènes g et b globine 4-2-1-3-Interaction LCR-gènes
5- Déterminants génétiques de l’expression d’hémoglobine fœtale chez l’adulte 5-1- Persistances héréditaires d’hémoglobine fœtale (PHHF) 5-1-1- Bases moléculaires des PHHF liées au locus b globine 5-1-1-1- PHHF délétionnelles 5-1-1-2- PHHF non délétionnelles 5-1-2- PHHF non liées au locus b globine 5-2- Modulation de l’expression d’hémoglobine fœtale dans les syndromes b thalassémiques et drépanocytaires 5-2-1- Haplotypes b globine 5-2-2- Polymorphisme en 158 de Gg 5-2-3- Autres polymorphismes 5-2-4- Séquences polymorphes potentiellement régulatrices 5-2-4-1- 5’ HS2 du LCRb 5-2-4-2- Séquences introniques (IVS2) de Gg et Ag 5-2-4-3- Silencer en 5’ du gène b globine 5-3- Chromosome X 6- Induction pharmacologique de l’hémoglobine fœtale
LISTE DES ABREVIATIONS
aa Acide aminé ADN Acide désoxyribonucléique CDP CAAT displacement protein C/EBP CAAT/ enhancer binding protein Dnase désoxyribonucléase EKLF Erythroid Kruppel Like Factor FCP F cell production Hb Hémoglobine HbF Hémoglobine fœtale HS Hypersensible site IVS Intervening sequence Kb Kilobase Pb Paire de base PHHF Persistance héréditaire d’ hémoglobine fœtale OCT Octamere transcription factor RFLP Restriction fragment lenght polymorphism 1- L’hémoglobine 1-1- Notions d’évolution Au cours de l’évolution, ferreuxl’hémoglobine, métalloprotéine à fer ( Fe2+), a acquis de nouvelles propriétés fonctionnelles dont la plus importante reste la capacité à fixer et à redistribuer l’oxygène. Largement répandue dans la biosphère, l’hémoglobine est retrouvée, sous diverses formes, chez la plupart des organismes vivants : procaryotes, champignons, plantes et animaux vertébrés et invertébrés (pour revue Terwilliger, 1998). L’origine de l’hémoglobine est ancienne. Elle remonterait aux procaryotes strictement anaérobies qui auraient utilisé cette molécule pour neutraliser l’oxygène atmosphérique qui leur était toxique, il y’a plusieurs milliards d’années. Dès que ces micro-organismes eurent développé leur capacité à utiliser l’oxygène en tant qu’accepteur d’électrons, la fixation d’O2et son transfert au niveau de la chaîne respiratoire devinrent vitales pour les processus biochimiques. Chez les plantes, l’hémoglobine, d’abord retrouvée dans les racines des Légumineuses symbiotiques (d’où le nom de léghémoglobine), a pour fonction de faciliter la diffusion d’O2 vers les bactéries aérobies fixant l’azote. Récemment, des gènes codant pour une léghémoglobine dans des plantes non symbiotiques, ont été identifiés. Cette hémoglobine interviendrait également dans la diffusion intracellulaire d’O2 vers les mitochondries des cellules métaboliquement actives. D’où l’hypothèse que l’hémoglobine
serait présente dans tout le règne végétal. L’hémoglobine n’aurait acquis son rôle de transporteur à distance d’O2chez les animaux pluricellulaires, qu’après la divergence entre hémoglobines animale et végétale, il y’a quelques 1500 millions d’années. Chez les vertébrés, outre son rôle dans le transport d’O2des poumons aux tissus, l’hémoglobine participe au transfert d’une partie du CO2des tissus vers les poumons , et maintien au de l’équilibre acido-basique. Toutes les hémoglobines dériveraient d’un gène ancestral commun qui à la suite de processus complexes; duplications de gènes, perte d’introns, délétions, divergences de séquences par mutations et conversions géniques, a donné naissance à des hémoglobines extrêmement diversifiées dont la complexité structurale est allée de pair avec les adaptations fonctionnelles.
Du fait de son abondance et de sa grande accessibilité, l’hémoglobine humaine a été la protéine la mieux étudiée. D’ailleurs, c’est la première protéine mutée qui a été caractérisée dans une maladie d’origine génétique, la drépanocytose (Sickle Cell Disease), par Pauling et Itano en 1949. Depuis, la biologie moléculaire a permis un essor très important dans l’étude des bases génétiques de cette maladie ainsi que dans d’autres hémoglobinopathies d’origine héréditaire. Cela s’est concrétisé par l’obtention de nombreux modèles de souris transgéniques dont celles exprimant notamment une hémoglobine mutée, l’HbS humaine (Fabryet al., 1992; Changet al., 1998); ces modèles pouvant également servir de base d’étude pour d’éventuelles thérapies (Fabryet al., 2001). Les gènes de la famille globine des vertébrés ont été également intensivement étudiés. Ils constituent en effet un outil pour la compréhension des mécanismes moléculaires à la base de la diversité génique d’une part et d’autre part représentent un modèle remarquable pour l’étude des structure, fonction et régulation de l’expression des gènes d’eucaryotes notamment des gènes appartenant à une famille multigénique: l’étude de la régulation des gènes de globine a permis une avancée importante dans la compréhension des mécanismes contrôlant la transcription des gènes au cours de la différenciation tissulaire et du développement. 1-2- Les hémoglobines humaines Les hémoglobines humaines sont des tétramères constitués de deux types de sous-unités, a et b. Dans le globule rouge de l’adulte sain, trois hémoglobines différentes coexistent : *L’hémoglobine A ou adulte (a2b2): représente la majorité des hémoglobines retrouvées dans le globule rouge (97% de l’hémoglobine totale). *L’hémoglobine A2, (a2d2), constitue moins de 3% des hémoglobines érythrocytaires. *L’hémoglobine F ou fœtale (a2g2) est présente à l’état de traces (moins de 1%). Des anomalies structurales de l’hémoglobine existent. Elles peuvent n’avoir aucune repercussion clinique (hémoglobine D Ouled Rabah, utilisée comme marqueur génétique) ou au contraire provoquer des désordres hématologiques majeurs. C’est le cas des hémoglobines S (S pour sickle, c’est à dire faucille), C ou d’autres hémoglobines instables.
1-3- Evolution ontogénique des hémoglobines humaines Chez l’Homme, l’érythropoïèse débute dans la lignée primitive érythroblastique du sac vitellin dès la fin de la troisième semaine de gestation du fait de l’activation des loci a et b .Trois hémoglobines embryonnaires sont alors successivement synthétisées : Gower 1(x2e2), Gower 2 (a2 e2) et Portland (x2g2). Ces hémoglobines ont pu être purifiées et caractérisées récemment par l’obtention de souris transgéniques exprimant à un taux élevé les gènes codant ces protéines (He et Russell, 2001). Chez l’Homme, dès la cinquième semaine de gestation, les hémoglobines embryonnaires sont progressivement remplacées par l’hémoglobine fœtale (a2g2) qui devient alors majoritaire à partir de la dixième semaine de gestation et ce jusqu’à la naissance. L’hémoglobine fœtale est d’abord synthétisée dans le foie (jusqu’à la vingtième semaine) puis dans la rate et la moelle osseuse. Bien que les chaînes g soient synthétisées à un taux largement supérieur à celui des chaînes b / b = 50/1), cesdurant les trente premières semaines de gestation (rapport g dernières sont détectables à partir de la dixième semaine. Leur synthèse augmentera progressivement durant le développement intra-utérin. A la naissance, l’HbA représentera 10% de l’hémoglobine totale. Environ 6 mois à un an après la naissance, l’hémoglobine fœtale, du fait de la commutation hémoglobine fœtale® adulte, chutera et ne constituera que moins de 3% de hémoglobine l’hémoglobine totale. Ala fin de la deuxième année, le taux d’hémoglobine fœtale se stabilisera (moins de 1%): le globule rouge contient alors les taux d’hémoglobines fœtale et adultes caractéristiques du globule rouge adulte. Parallèlement au changement des sites érythropoiétiques au cours du développement ontogénique, se produit une évolution dans la morphologie des cellules érythroides: dans le sac vitellin les cellules dites embryonnaires ou primitives sont nucléées alors que dans le foie fœtal et la moelle osseuse (cellules définitives) elles ne le sont plus. 2- Les gènes de globine 2-1- Localisation et organisation des gènes de globine C’est par des techniques de fusion cellulaire et d’hybridation que la localisation exacte des gènes de globine a pu être déterminée. Ces gènes se répartissent en deux familles : - Famille des gènes a situés sur le bras court du chromosome 16 (16p 13.3) (Deisserothet al.,1977). - Famille des gènes bsur le bras court du chromosome 11 (11p 15.5) (Deisserothet al., 1978; Leboet al., 1979; Fritschet al.,1980). Le complexe a, qui s'étend sur une distance de 30 kb, comprend de 5’ à 3’: le gène x codant pour une chaîne présente uniquement au stade embryonnaire, 3 pseudogènes (yx, ya2,ya1), et les deux gènes a2 et a1codant une chaîne polypeptidique identique a. En effet, ces deux gènes très homologues
