MINISTERE DE L'EDUCATION NATIONALE
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2002
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Niveau: Supérieur
MINISTERE DE L'EDUCATION NATIONALE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE Présenté par Sandra PRÉVÉRAL Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes STRATÉGIES D'IDENTIFICATION DE PARTENAIRES CELLULAIRES DES PROTEINES VIRALES VPR ET Pr55gag DE VIH-1 Soutenu le 17 octobre 2002 devant le jury suivant : Président : Pr. Jean-Claude GLUCKMAN Rapporteur : Dr Bruno CANQUE Examinateur : Dr Pablo GLUSCHANKOF Examinateur : Dr Serge BENICHOU Examinateur : Dr Arielle ROSENBERG Laboratoire E.P.H.E Directeur : Pr. Jean-Claude GLUCKMAN (Sciences de la vie et de la Terre) INSERM E 00-13 - Hôpital Saint-Louis Institut Universitaire d'Hématologie Centre Hayem - 1er étage 1, avenue Claude Vellefaux 75010 Paris Laboratoire des Rickettsies, Faculté de Médecine Directeur : Pr. Didier RAOULT IFR 48 “ Pathologies Transmissibles et Pathologies Infectieuses Tropicales ” 27, bd Jean Moulin 13385 Marseille cedex 05 Résumé des travaux : Le cycle de réplication du virus de l'immunodéficience humaine est défini comme une cascade EPHE Banque de Monographies SVT 1
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MINISTERE DE L'EDUCATION NATIONALE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE Présenté par Sandra PRÉVÉRAL Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes STRATÉGIES D'IDENTIFICATION DE PARTENAIRES CELLULAIRES DES PROTEINES VIRALES VPR ET Pr55gag DE VIH-1 Soutenu le 17 octobre 2002 devant le jury suivant : Président : Pr. Jean-Claude GLUCKMAN Rapporteur : Dr Bruno CANQUE Examinateur : Dr Pablo GLUSCHANKOF Examinateur : Dr Serge BENICHOU Examinateur : Dr Arielle ROSENBERG Laboratoire E.P.H.E Directeur : Pr. Jean-Claude GLUCKMAN (Sciences de la vie et de la Terre) INSERM E 00-13 - Hôpital Saint-Louis Institut Universitaire d'Hématologie Centre Hayem - 1er étage 1, avenue Claude Vellefaux 75010 Paris Laboratoire des Rickettsies, Faculté de Médecine Directeur : Pr. Didier RAOULT IFR 48 “ Pathologies Transmissibles et Pathologies Infectieuses Tropicales ” 27, bd Jean Moulin 13385 Marseille cedex 05 Résumé des travaux : Le cycle de réplication du virus de l'immunodéficience humaine est défini comme une cascade EPHE Banque de Monographies SVT 1
- ltr
- famille des récepteurs aux chimiokines
- intégration de l'adn viral dans le chromosome de la cellule hôte
- précurseur polypeptidique
- cellule
- initiation de la transcription des gènes viraux sous le contrôle du ltr viral
- protéines virales
- protéine cellulaire
- adn polymérase
MINISTERE DE L’EDUCATION NATIONALE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE Présenté par Sandra PRÉVÉRAL Pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes STRATÉGIES D’IDENTIFICATION DE PARTENAIRES CELLULAIRES DES PROTEINES VIRALES VPR ET Pr55 gag DE VIH-1 Soutenu le 17 octobre 2002 devant le jury suivant : Président : Pr. Jean-Claude GLUCKMAN Rapporteur : Dr Bruno CANQUE bruno.canque@jupiter.chu-stlouis.fr Examinateur : Dr Pablo GLUSCHANKOF pablo.gluschankof@medecine.univ-mrs.fr Examinateur : Dr Serge BENICHOU Examinateur : Dr Arielle ROSENBERG Laboratoire E.P.H.E Directeur : Pr. Jean-Claude GLUCKMAN (Sciences de la vie et de la Terre) INSERM E 00-13 - Hôpital Saint-Louis Institut Universitaire d'Hématologie Centre Hayem - 1er étage 1, avenue Claude Vellefaux 75010 Paris Laboratoire des Rickettsies, Faculté de Médecine Directeur : Pr. Didier RAOULT IFR 48 “ Pathologies Transmissibles et Pathologies Infectieuses Tropicales 27, bd Jean Moulin 13385 Marseille cedex 05 Résumé des travaux : Le c de ré du virus de l’immunodéficience humaine est défini comme une cascade
d’événements moléculaires mettant en jeu des protéines codées par le génome viral mais également des protéines de la cellule hôte. De façon à mieux comprendre les relations entre le virus et la cellule infectée, nous nous sommes intéressés aux interactions entre le précurseur Gag du VIH-1 et les protéines virales ou cellulaires. La Pr55 gag est un précurseur polypeptidique nécessaire et suffisant à l’accomplissement des deux dernières étapes du cycle viral. En effet, la Pr55 gag orchestre l’assemblage des composés des nouveaux virions sous la membrane plasmique de la cellule productrice et permet leurs libérations dans le milieu extracellulaire par bourgeonnement de cette membrane. Ces étapes sont déterminantes pour l’infectivité virale car elles garantissent une composition et une structure correctes des virions produits. La protéine virale Vpr interagit avec la Pr55 gag et est encapsidé dans la particule virale. Des études sur la protéine Vpr, par la technique du double hybride, ont révélé qu’elle interagissait avec des partenaires cellulaires. Dans un premier temps, nous avons étudié le rôle potentiel de l’interaction entre Vpr et deux protéines cellulaires impliquées dans la réparation de l’ADN, l’Uracil DNA Glycosylase (UNG) et HHR23A. Nos résultats indiquent que l’UNG est incorporé dans les virions grâce à son interaction avec Vpr. De plus, nous démontrons que la présence de l’UNG dans la particule virale limite le nombre de mutations présentes sur le génome du virus. D’autre part, notre travail sur HHR23A et Vpr a consisté à étudier le rôle potentiel de cette interaction au niveau de différentes fonctions de Vpr lors du cycle viral. Les résultats obtenus ne permettent pas de corréler cette liaison avec une des fonctions de Vpr étudiées. Enfin, notre travail s’est également axé sur la compréhension du mécanisme moléculaire mis en jeu par la Pr55 gag lors du bourgeonnement viral. Les données de la littérature s’accordent pour énoncer clairement que des protéines cellulaires sont recrutées par Gag pour mener à bien cette étape du cycle du virus. A ce jour, différents partenaires cellulaires du précurseur Gag ont été identifiés mais seule le protéine Tsg101 semble avoir un rôle dans la fonction de bourgeonnement de la Pr55 gag . De ce fait, nous avons mis au point un système d’étude permettant de définir de façon directe les partenaires cellulaires de la Pr55 gag impliqués dans le bourgeonnement viral. Le modèle cellulaire choisi pour développer cette recherche est la levure Saccharomyces cerevisiae . Les pseudoparticules virales produites par des levures transformées avec le gène gag sauvage ont les même caractéristiques physiques que celles libérées par des cellules de mammifères, en particulier les lymphocytes T CD4+, exprimant le gène viral. Par conséquent, ce système expérimental s’avère être d’une grande qualité pour l’identification de partenaires cellulaires impliqués dans le bourgeonnement de la Pr55 gag en utilisant des mutants de levure. TABLE DES MATIERES I. INTRODUCTION 3 A. GENERALITES 1. La maladie 2. Les cellules cibles 3. Le VIH B. ASPECTS STRUCTURAUX DU VIH-1
3 3 3 4 4
4 5 5 6 6 8 9 9 10 10 11 11 13 13 14 14 15 16 16 17 18
1. Le génome 2. Les protéines virales a. Les protéines de structure b. Les protéines à activité enzymatique c. Les protéines de régulation 3. Morphologie de la particule virale C. LE CYCLE REPLICATIF DU VIH-1 1. L’entré 2. La transcription inverse 3. L’import nucléaire 4. L’intégration et la phase post-intégrative 5. L’assemblage et le bourgeonnement D . LES PARTENAIRES MOLECULAIRES DU PRECURSEUR GAG 1. Pr55 gag et l’enveloppe 2. Pr55 gag et L’ARN viral 3. Pr55 gag et Vpr 4. Pr55 gag et les protéines cellulaires 5. Pr55 gag et la membrane plasmique E. LE PRECURSEUR GAG ET LE BOURGEONNEMENT 1. Les domaines de la Pr55 gag impliqués dans le bourgeonnement viral 2. Les protéines cellulaires et le bourgeonnement viral I.INTRODUCTION: A. GENERALITES: 1. La maladie Le syndrome de l’immunodéficience acquise (SIDA) est un déficit immunitaire profond lié à la destruction prolongée des lymphocytes T-CD4+. L’agent pathogène responsable de cette maladie est le virus de l’immunodéficience humaine (VIH). Aujourd'hui le SIDA a déjà coûté la vie à plus de 16 millions de personnes et 15000 continuent d'être infectées chaque jour dont 95 % dans les pays en voie de développement. Les modes de contamination sont sexuel, materno-feotal et sanguin. 2. Les cellules cibles
Les cellules de la lignée monocyte/macrophage (Ho et al., 1986), les lymphocytes T CD4+ (Klatzmann et al., 1985) et les cellules dendritiques (Macatonia et al., 1990) sont les cibles majeures du VIH. Le tropisme du virus pour ces cellules dépend de l’expression en surface du récepteur CD4 et de co-récepteurs appartenant à la famille des récepteurs aux chimiokines (pour revue, Clapham et al., 2001). Les souches virales appelées "M-tropiques" présentent un tropisme préférentiel pour les lymphocytes T primaires et les monocytes/macrophages alors que les souches appelées "T-tropiques" infectent préférentiellement les lymphocytes T et les lignées lymphocytaires ( pour revue voir Moore et al., 1997). En revanche, les cellules dendritiques peuvent être infectées par les deux types de souche en fonction de leur stade de maturation (Canque et al., 1999). Certaines lignées cellulaires n’exprimant pas la molécule CD4 semblent toutefois infectables par le VIH, leur permissivité étant le plus souvent associée à l’expression de glycolipides à leur surface (Fantini et al., 1993; Fantini et al.,1997). Cette infection est en général moins efficace et observée in vitro avec des stocks viraux à haut titre infectieux. 3. Le VIH Le VIH fait partie des lentivirus, sous-famille des rétrovirus. Ce sont des virus enveloppés qui sont libérés des cellules productrices par bourgeonnement. Leur information génétique est portée par deux ARNs se répliquant via un ADN double-brin (ou provirus) grâce à l'enzyme clé de cette famille, la transcriptase inverse. Il existe deux types de VIH, le VIH de type 1 (VIH-1) et de type 2 (VIH-2). Ils partagent de nombreuses propriétés biologiques ainsi qu’une structure génomique semblable. L’homologie de leur séquence est d’environ 50% alors que les différents isolats du VIH-1 diffèrent en moyenne de 10%. Les souches de VIH-2 sont moins pathogènes que celles du VIH-1. En effet, chez les individus infectés par le VIH-2 la latence clinique est plus longue et la mortalité plus faible (Essex et Kanki, 1988). B. ASPECTS STRUCTURAUX DU VIH-1: 1. Le génome L'information génétique du VIH-1 est codée par deux ARNs monocaténaires de polarité positive associés à leur extrémité 5'. Le génome viral est composé des gènes: gag, gag-pol, env, vif, vpr, vpu, tat, rev et nef . Le gène gag code pour la Pr55Gag, précurseur polypeptidique de protéines de structures, telle que la matrice (MA), la capside (CA), la nucléocapside (NC), la protéine p6 et de deux peptides de jonction nommés sp1 et sp2. Le gène gag-pol code soit pour la Pr55gag soit pour la protéase (PR), la transcriptase inverse (RT) et l’intégrase (IN). C’est le changement du cadre de lecture au niveau de la partie codante pour la NC qui est responsable de cet événement. Le rapport entre le taux d’expression de la Pr55gag et les enzymes PR, RT et IN est de 20 pour 1 (Jacks et al., 1988). En position 3’ du gène gag-pol se trouve le gène env qui code pour la gp160, précurseur de la glycoprotéine de surface (gp120) et de la glycoprotéine transmembranaire (gp41). Les gènes vif , vpr , vpu , nef , tat et rev codent pour les protéines régulatrices.
De part et d’autre du génome se trouvent de courtes séquences appelées LTR, pour Long Terminal Repeat, nécessaires à l’intégration et à l’expression du génome viral au sein de la cellule hôte . 2.Les protéines virales a. Les protéines de structure La protéine de la matrice (MAp17) est responsable de l’ancrage à la membrane du précurseur GAG. La matrice participe également au transport nucléaire de l’ADN viral rétrotranscrit qui est contenu à l’intérieur d’un complexe protéique appelé le complexe de pré-intégration (PIC) (Bukrinskaya et al.,1996 ; Harraf et al., 2000) ainsi qu’à l’incorporation de l’oligomère gp120/gp41 au cours de la morphogenèse virale (Yu et al., 1992). Dans le virion, la MA est localisée à la face interne de la membrane virale alors que la protéine de la capside (CAp24) structure le nucléoïde du virion en forme de cône. La nucléocapside (NCp7) possède des séquences dites en doigts de zinc interagissant étroitement avec l’ARN viral (Darlix et al., 1990; De Rocquigny et al., 1992). Enfin, la protéine p6 intervient dans la liaison du nucléoïde avec la matrice et serait indispensable au bon déroulement de la morphogénèse de la particule virale (Göttlinger et al., 1991). Elle est aussi impliquée dans le processus de bourgeonnement et de libération des virions à partir de certaines cellules (Huang et al., 1995 ; Demirov et al., 2002). Cette protéine est également responsable de l’incorporation de la protéine Vpr dans les virions (Lavallée et al., 1994). Les protéines d’enveloppe sont présentes dans la bicouche lipidique de la particule virale. La glycoprotéine externe gp120 est responsable du tropisme du virus en interagissant spécifiquement avec la molécule CD4 présente à la surface des cellules cibles. Elle contient une alternance de domaines conservés (C1 à C5), qui participent à la liaison avec la molécule CD4, ainsi que des domaines très variables (V1 à V5). La glycoprotéine transmembranaire gp41 , qui interagit avec la gp120, contient “ le peptide de fusion permettant la fusion des membranes virales et cellulaires (Gallaher, 1995). b. Les protéines à activité enzymatique La protéase PR mature est libérée par clivage auto-catalytique du Pr160gag-pol. Cette enzyme est responsable de la maturation des précurseurs Pr55gag et Pr160gag-pol libérant les différentes protéines de structure ainsi que la transcriptase inverse et l’intégrase. La transcriptase inverse RT est une ADN polymérase ARN/ADN dépendante, possédant une activité RNase-H et responsable de la rétrotranscription du génome viral. L’intégrase IN, enzyme nécessaire à l’intégration de l’ADN viral dans le chromosome de la cellule hôte, possède à la fois une activité endonucléase et une activité ligase. Cette enzyme fait également partie du complexe de préintégration (Gallay et al., 1997 ; Depienne et al., 2001). c. Les protéines de régulation Dans le cas du virus HIV-1, les protéines de régulation sont au nombre de six: Tat, Rev, Vif, Vpr, Vpu et Nef. Seules les protéines Tat et Rev sont indispensables au cycle viral. La protéine Tat (Trans-Activator of Transcription) est essentielle à l’expression de tous les gènes viraux (Arya et al., 1987). Son rôle principal se situe au niveau transcriptionnel en augmentant à la fois l’initiation de la transcription des gènes viraux sous le contrôle du LTR viral (Laspia et al., 1989) et l’efficacité d’élongation des ARN transcrits (Kessler et al., 1992). La protéine Rev (Regulation of expression of virions) est un transactivateur post-transcriptionnel qui se lie, sous forme multimérique, à une séquence nucléotidique spécifique située dans la partie codante du gène env et appelée RRE (Rev Responsive Element).
Les protéines “auxiliaires Nef, Vif, Vpr et Vpu ne sont pas toujours indispensables pour la réplication du virus HIV-1 in vitro mais elles augmentent l’infectivité virale. La protéine Nef (Negative factor) a un rôle dans la réplication virale et le pouvoir infectieux des virions (Schwartz et al., 1995; Collette et al., 1999). Il a été aussi démontré qu’elle régule négativement la présence de CD4 à la membranaire plasmique (Garcia et al., 1991) et l’expression des molécules du CMH classe I (Complexe majeur d’histocompatibilité) en surface des cellules infectées (Schwartz et al., 1996; Le Gall et al., 1998). La protéine Vpu (Viral protein U) participe à une dégradation rapide et sélective de la molécule CD4, probablement par la voie de dégradation du protéasome (Margottin et al., 1998) et facilite le relargage des particules virales dans le milieu extracellulaire (Klimkait et al., 1990; Terwilliger et al., 1989; Handley et al., 2001). L’effet de la protéine Vif (Viral infectivity factor) sur l’infectivité virale dépend du type de cellule infectée. Il semblerait que cette protéine augmente la réplication virale en levant l’inhibition d’un facteur cellulaire à ce jour inconnu (Gaduzda et al., 1992; Simon et al., 1998). La protéine Vpr (Virion protein R) est une protéine basique de 15 kDa synthétisée tardivement au cours du cycle viral et présente majoritairement dans le noyau des cellules infectées. Vpr est incorporée spécifiquement dans les particules virales en s’associant avec le précurseur Gag, via son domaine C terminal (Lu et al., 1995). De ce fait, Vpr joue un rôle dans les événements précoces du cycle viral dès l’entrée du virus dans la cellule. Différents travaux ont montré l’implication de Vpr, associée à la protéine de la matrice (MA) et à l’intégrase (IN), dans le transport du complexe de pré-intégration vers le noyau de cellules différenciées en arrêt de division, tels que les macrophages (Heinzinger et al., 1994 ; pour revue Fouchier et al., 1999). Un nouveau concept d’entrée du PIC dans le noyau a été décrit par M. Segura-Totten et C. de Noronha (Segura-Totten et Wilson, 2001; Noronha et al, 2001). Le modèle propose que Vpr, détaché du PIC, entre dans le noyau par les pores nucléaires et désorganise la structure filamenteuse de la lamina présente sous l’enveloppe nucléaire. Cet événement créerait la décondensation de la chromatine ainsi que la rupture momentané de l’enveloppe nucléaire laissant ainsi pénétrer le PIC dans le noyau. Les auteurs montrent également la fuite de protéines nucléaires dans le cytoplasme des cellules infectées et émettent l’hypothèse que la présence de ces protéines dans ce compartiment pourrait engendrer des signaux mitotiques expliquant l’arrêt du cycle cellulaire en G2 observé chez des cellules exprimant Vpr. En effet, une autre fonction de Vpr est d’induire l’arrêt des cellules en phase G2/M du cycle cellulaire (Jowett et al.,1995). Vpr pourrait moduler la voie de phosphorylation/déphosphorylation de plusieurs enzymes cellulaires requises au moment de la mitose et participant à la régulation du cycle cellulaire (Hrimech et al., 2000; pour revue Elder et al. 2002). Segura-Totten et Noronha proposent, par contre, que l’arrêt du cycle cellulaire pourrait être la conséquence de la rupture de l’enveloppe nucléaire. Hormis le fait que cette polémique soit encore d’actualité, l’arrêt du cycle cellulaire en phase G2 semblerait induire une augmentation de la production virale (Goh, et al., 1998). La protéine Vpr possède également la capacité de transactiver de façon modeste le LTR du VIH-1. Cette transactivation serait suffisante pour promouvoir l’activité du LTR immédiatement après l’intégration et avant la synthèse de la protéine Tat (Hrimech et al., 1999; Sawaya et al., 2000; Vanitharani et al., 2001). L’interaction de Vpr avec certains facteurs de transcription comme TFIIB et Sp1 serait à la base de ce mécanisme (Agostini et al., 1999 et Wang et al., 1995).De plus, l’incorporation de Vpr dans la particule virale diminue le taux de mutation de la transcriptase inverse (Mansky, 1996).
3. Morphologie de la particule virale La particule virale infectieuse est sphérique d'un diamètre de 100 à 140 nm (Gelderblom et al., 1991). La membrane externe du virus, issue du bourgeonnement de la particule à la surface des cellules infectées, est constituée d'une bicouche lipidique contenant des protéines cellulaires et virales (Henderson, et al., 1987; Arthur, et al., 1992). Cette enveloppe externe est surmontée de spicules correspondant aux trimères du complexe gp120/gp41 (Earl, et al., 1990). Pendant la morphogenèse du VIH-1, la particule virale est d’abord formée dans une conformation dite immature où le précurseur Gag est assemblé sous la membrane lipidique . Pour être infectieuse, la particule doit passer à une structure mature, où après clivage de la Pr55gag par la protéase virale, les protéines libérées se réorganisent. De ce fait, les protéines de la matrice (MA) tapissent l’intérieur de l’enveloppe lipidique abritant le core viral aussi appelé nucléoïde. Ce nucléoide est composé de la capside (CA), de la nucléocapside (NCp7), de la protéine p6, ainsi que des protéines à activité enzymatique qui sont la protéase PR, la transcriptase inverse RT (Reverse Transcriptase) et l'intégrase IN. Au cœur de ce nucléoïde se trouve l’ARN viral. C. LE CYCLE REPLICATIF DU VIH-1: 1. L’entrée Le cycle viral débute par l’interaction de la gp120 à la surface virale avec le récepteur CD4 présent à la membrane des cellules cibles. L’interaction CD4/gp120 n’est pas suffisante pour permettre l’entrée du virus puisque des co-récepteurs spécifiques sont requis. Ce sont des récepteurs naturels aux chimiokines b appartenant à une famille de protéines à sept domaines transmembranaires et associées à des protéines G. Les plus connus sont la fusine ou CXCR4 et CCR5. Les lymphocytes T primaires et les cellules dentritiques possèdent les co-récepteurs CXCR4 et CCR5 alors que les lignées T expriment exclusivement CXCR4 et les macrophages CCR5 (Alkhatib et al., 1996 ; Deng et al., 1996). Après la liaison de la gp120 avec la molécule CD4, la boucle V3 enfouie à l’intérieur de la protéine gp120 se trouve exposée. Ce domaine à séquence hypervariable est responsable du tropisme viral car il interagit de façon sélective avec le co-récepteur de la cellule cible (Doms et Peiper, 1997). Cette liaison déclenche le changement final de conformation de la glycoprotéine virale de surface permettant au peptide de fusion de la gp41 de s’insérer dans la membrane cellulaire et d’induire le processus de fusion membranaire. Lors de la pénétration du virus dans la cellule hôte, les protéines Env restent insérées dans la bicouche lipidique à la surface de la cellule infectée alors que le nucléoïde viral est libéré dans le cytoplasme. Enfin, la décapsidaption du core viral, par dissociation des protéines de la capside, permet au matériel génétique de se retrouver directement en contact avec le cytosol cellulaire. Avant l’insertion dans le génome de la cellule hôte, l’ARN viral doit subir une étape de transcription inverse.
2. La transcription inverse La transcription inverse est la synthèse d’ADN double brin à partir d’un brin d’ARN. Ce phénomène est couplé à la dégradation de l’ARN modèle. Cette étape est initiée dans la particule virale et s’achève dans le cytoplasme de la cellule infectée (Zhang et al., 1993; Zhang et al., 1994). L’enzyme (RT) responsable de ce processus est à l’origine d’une partie de la variabilité génétique des rétrovirus. En effet, contrairement aux ADNs polymérases cellulaires, la transcriptase inverse du VIH-1 est dépourvue d’activité exonucléase ce qui ne permet pas de corriger les mutations générées au cours de la synthèse de l’ADN viral. Le processus de transcription inverse peut être arbitrairement divisé en trois phases: -Une phase d’initiation où la transcriptase inverse virale initie le brin (-) de l’ADN . -Une phase d’élongation qui poursuit la synthèse de l’ADN (-). -Une phase de terminaison où le brin d’ADN (+) est synthétisé et la molécule d’ADN virale linéaire double brin discontinue est formé. L’étape de transcription inverse nécessite la mise en place d’un système multi moléculaire mettant en jeu un ARN de transfert cellulaire (tRNA lys 3 ) ainsi que des protéine virales comme Tat, Nef, Vif, In, Ncp7 et Vpr (pour revue voir Harrich et Hooker, 2002 ; Fassati et Goff, 2001) L’ADNc ainsi synthétisé doit parcourir une distance d’environ 20 mm pour passer du cytoplasme au noyau en traversant l’enveloppe nucléaire (Sherman et Greene, 2002). 3. L’import nucléaire Le VIH-1 se multiplie efficacement dans les cellules en division ainsi que dans les cellules quiescentes. Ce fait est attribué à la capacité du complexe de pré-intégration, constitué de l’ADNc viral, la MA, l’IN et Vpr, à être activement importé dans le noyau durant l’interphase. Les protéines MA (von Schwedler et al. 1994), IN (Bouyac-Bertoia et al., 2001) et Vpr (Jenkins et al., 1998) possèdent des séquences de localisation nucléaire (NLS) connues pour interagir avec une des voies de translocation dans le noyau, plus particulièrement celle médiée par des protéines de la famille des importines. Cependant, le rôle de chacune de ces séquences NLS dans le transport de l’ADN viral dans le noyau reste encore à identifier (pour revue Sherman et Greene, 2002). L insertion de l’ADN ’ viral dans le génome cellulaire s’effectue par l’action de l’enzyme intégrase. 4. l’Intégration et la phase post-intégrative Le site d’intégration de l’ADNc viral dans l’ADN cellulaire ne semble pas très spécifique pourtant cette insertion est généralement observée dans les régions transcrites de la chromatine (pour revue, Bushman, 2002). Les séquences nucléotidiques virales IR (Inverted Repeat) situées aux extrémités des régions LTR et qui constituent les sites de fixation de l'intégrase sont les seules séquences virales requises à cette étape. Une fois intégré dans le génome de la cellule hôte, l'ADN proviral sera exprimé par la machinerie cellulaire. Le LTR 5' porte les signaux d'initiation de la transcription alors que le LTR 3' présente un signal de polyadénylation. Les ARNs messagers de différentes tailles sont obtenus par épissage alternatif de l'ARN génomique. Ils sont ensuite exportés de façon contrôlée dans le cytoplasme pour y être exprimés. La quantité et la qualité des ARNm viraux au cours du cycle viral des lentivirus sont contrôlées par l'action séquentielle des protéines Tat et Rev. On sépare la traduction en deux phases: une phase précoce où sont synthétisées les protéines Tat, Rev et Nef et une phase tardive où sont produites les protéines Gag, Pol, Env, Vpr, Vpu et Vif. La totalité de l'ARN génomique néo-synthétisé n'est pas traduite puisqu’une partie est réservée en tant que génome pour les futurs virions. Les protéines virales peuvent alors exercer leurs fonctions et permettrent la formation et la libération de nouvelles virales.
5. L'assemblage et le bourgeonnement Avant de quitter la cellule productrice, le nouveau virion s’organise sous la membrane plasmique. L’ensemble des constituants de ce dernier, protéines ou acides nucléiques, doit se rassembler en un même point d’ancrage sous une structure particulière et définie. Le bon déroulement de cette étape conditionne le bourgeonnement à la membrane plasmique et donc la production des nouvelles particules virales. (cf aussi §E) Le précurseur Gag est la protéine clé de ces deux étapes. Il orchestre le recrutement et l’assemblage des molécules incorporées et fonde ainsi la structure dite immature des particules. A la suite de l’assemblage, la Pr55gag amorce l’étape de bourgeonnement. Le changement d’architecture finale du virion, passant d’un état immature à mature, reste dépendant des modifications du précurseur Gag. L’ensemble de ces événements place la Pr55gag comme le composant mais également le bâtisseur incontournable de la particule virale. D. LES PARTENAIRES MOLECULAIRES DU PRECURSEUR GAG. Au cours du cycle viral, le précurseur gag participe à de nombreuses étapes où il tisse un réseau d’interactions aussi bien avec des molécules virales que cellulaires. 1.Pr55 gag et l’enveloppe. Plusieurs observations suggèrent une interaction entre la protéine d’enveloppe et le précurseur Gag. En effet, des expériences dans des cellules épithéliales polarisées montrent qu’en absence de la gp160, le précurseur Gag bourgeonne aussi bien au pole apical qu’au pole basal. En revanche, si l’on co-exprime la gp160 et la Pr55gag, les particules sont exclusivement libérées au pôle basal (Lodge et al., 1997; Owens et al., 1991). Ces observations indiquent que la protéine Env est responsable de la polarisation du bourgeonnement de Gag à la membrane plasmique. D’autre part, il a été observé que l’expression de la gp160 en absence de toute autre protéine virale aboutissait à sa localisation membranaire suivi d’une internalisation rapide. La coexpression de la Pr55gag et de la gp160 diminue efficacement ce phénomène suggérant que Gag puisse entraver l’interaction de la protéine d’enveloppe avec la machinerie d’endocytose (Egan et al., 1996). Dans les virions immatures, des travaux récents indiquent que la solubilisation de la bicouche lipidique par l’action d’un détergent non-ionique a pour conséquence la disparition de 50% de la gp120 à la surface de la particule nue, alors que lorsque le traitement est effectué sur des virions matures, la totalité de la glycoprotéine de surface est éliminée (Wyma et al., 2000). L’ensemble de ces résultats montre d’une part que la Pr55gag stabilise la localisation des glycoprotéines virales à la membranes plasmique, et d’autre part qu’elle consolide l’intégrité du complexe gp120/gp41 au sein du virion immature. L’interaction entre la gp41 et le précurseur Gag a été biochimiquement démontrée dans des virions immatures (Wyma et al., 2000). La mutation ponctuelle des résidus 12, 30 et 34 de la matrice est critique pour l’incorporation de la gp41 à la surface virale (Freed et Martin, 1996). En ce qui concerne la gp41, il semblerait qu’un domaine correspondant à une centaine d’acides aminés, dans sa partie cytoplasmique soit nécessaire à cette interaction (Hourioux et al., 2000). L’ensemble de ces données confère à l’interaction Gag-Env un rôle bidirectionnel puisque si la gp160 polarise le bourgeonnement de Gag, ce dernier maintient la localisation cellulaire de la gp160 ainsi
que sa structure entre l’étape d’assemblage et l’entré du virus dans une nouvelle cellule. 2. Pr55 gag et l’ARN viral. Lors de l’assemblage, le précurseur Gag se lie à l’ARN viral et permet son encapsidation dans le virion (Jowett et al., 1992). Bien qu’il y ait peu de spécificité sur la séquence d’ARN incorporée dans la particule virale, il semble que le précurseur Gag d’un rétrovirus donné se liera préférentiellement à son propre ARN codant plutôt qu’à celui d’un autre rétrovirus. Cette spécificité semble être engendrée par la liaison de la NC à l’ARN (Zhang et Barklis, 1995). Outre le recrutement du génome viral, cette interaction a également été rapportée comme facilitant et stabilisant la dimérisation de l’ARN viral (Darlix et al, 1990 et Skaguchi et al., 1993 ; Feng et al., 1996). L’implication des domaines en doigt de zinc de la NC dans cette interaction a été mise en évidence grâce à des expériences de mutagenèse (Aldovini et Young, 1990; Schartz et al., 1997 ; Clever et al., 2000) ainsi qu’aux informations recueillies par la cristallographie du complexe ARN-NC (De Guzman et al. ,1998). 3 . Pr55 gag et Vpr. La protéine Vpr est présente à l’intérieur de la particule virale (Cohen et al., 1990). Différents travaux identifient l’interaction entre le domaine C-terminal du précurseur Gag et Vpr comme étant responsable de cette localisation (Lavallée et al., 1994; Paxton et al., 1993). Plus précisément, la liaison G XX de la p6 (Selig et al, 1999). ag-Vpr met en jeu le domaine riche en leucine (L ) 4 L’incorporation spécifique de Vpr dans les virions suggère que le précurseur recrute cette protéine virale dans un but précis. En effet, il a été montré qu’un virus défectif pour l’incorporation de Vpr présentait un taux d’erreur de la RT quatre fois plus élevé qu’un virus sauvage (Mansky, 1996). Ainsi, d’une manière directe ou indirecte, Vpr influe sur l’étape de rétrotranscription. La recherche de partenaires de Vpr par la technique du double hybride a aboutit, entre autres, à l’identification de deux enzymes impliquées dans la réparation de l’ADN; l’Uracil DNA Glycosylase (UNG) et HHR23A. Mes travaux réalisés sur le rôle fonctionnel de ses interactions sont joints, sous leur forme éditée, dans la partie résultats. 4. La Pr55 gag et les protéines cellulaires La plupart des protéines cellulaires, partenaires potentiels de la Pr55gag, ont été identifiées par des recherches faisant appel à la méthode du double-hybride. Parmi les partenaires les plus étudiés se trouvent la cyclophiline A (CypA), enzyme à activité d’Isomérase (Luban et al., 1993 ; Francke et al., 1994), la protéine Tsg101, ayant des homologies avec les protéine E2 participant au ciblage des protéines vers le protéasome (cf. §E) (Garrus et al., 2001; VerPlank et al, 2001) et la protéine KIF-4 de la famille des kinesines (Tang et al., 1999). D’autres partenaires issus d’un crible utilisant la matrice comme appât se sont révélés interagir également avec le précurseur dans son contexte mature. Notamment HO3, la synthétase de tARN his (Lama et Trono, 1998) et l’EF1a, le facteur d’élongation alpha-1 (Cimarelli et Luban, 1999). De plus, des travaux basés sur des évidences bibliographiques comme l’utilisation de l’ATP pour l’assemblage de Gag (Lingappa et al., 1997) et la possibilité du recrutement d’une protéine chaperone, ont aboutit à l’identification par co-immunoprécipitation de la protéine HP68 interagissant avec la séquence CA du précurseur Gag autoassemblé (Zimmerman et al., 2002). L’identification de
l’interaction entre la Pr55gag et l’actine (cf. §E) (Rey et al., 1996) fût également établie à la suite de plusieurs résultats suggérant l’implication de l’actine dans le bourgeonnement viral, comme par exemple, la présence d’actine dans les virions (Ott et al., 1996) ou la colocalisation de l’actine avec le précurseur Gag dans la cellule infectée (Pearce-Pratt et al., 1994). A ce jour, la CypA, supposée intervenir lors de la décapsidation du core viral (Saphire et al., 2002), et Tsg 101, impliqué dans l’étape de bourgeonnement viral (cf. §E) (Garrus et al., 2001; VerPlank et al, 2001), sont les seules partenaires cellulaires du précurseur Gag démontrés actifs dans un mécanisme moléculaire du cycle viral. 5. Pr55 gag et la membrane plasmique. Le précurseur Gag s’ancre aux structures membranaires grâce à la fonction myristoil présente à son extrémité N-terminale (Zhou et al, 1994; Spearman et al, 1994). La spécificité vis à vis du partenaire membranaire implique le domaine de la matrice. En effet, une large délétion dans les séquences codantes pour la MA aboutit à un assemblage du précurseur au niveau des membranes du réticulum endoplasmique (Facke et al., 1993 ; Gallina et al., 1994). De plus, la mutation d’un seul acide aminé entre les résidus 84 et 88 redirige la Pr55Gag vers l’appareil de Golgi ou vers certaines vésicules qui en dérivent (Freed et al., 1994). Par ailleurs, il a été suggéré que le point d’ancrage de la Pr55gag soit défini par la composition de la membrane plasmique. En effet, une localisation préférentielle d’oligomérisation du précurseur a été trouvée au niveau des radeaux lipidiques majoritairement composé de cholestérol (Ono, 2001). Bien que la liaison avec les phospholides soit due à des séquences de la matrice, il a été démontré que dans un virion mature la matrice était moins affine pour la membrane que dans son contexte précurseur (Zhou et Resh, 1996; Spearman et al, 1997). Ce résultat expliquerait l’étape de dissociation entre la matrice et l’enveloppe virale lors de l’entrée du virus dans la cellule. Du fait des qualités moléculaires du précurseur Gag, lui conférant une capacité à interagir spécifiquement avec les éléments viraux et cellulaires cités, la Pr55gag cible l’ensemble des composants de la particule virale à la membrane plasmique de la cellule infectée. E. LE PRECURSEUR GAG ET LE BOURGEONNEMENT: L’assemblage des composants viraux à la face interne de la membrane plasmique aboutit au bourgeonnement viral et à la libération dans le milieu extracellulaire de la particule nouvellement formée. Le précurseur Gag est le seul composant viral nécessaire et suffisant pour que cette étape puisse avoir lieu. En effet, l’expression du gène gag par différentes cellules eucaryotes libère, à partir de la membrane plasmique, des vésicules appelées pseudo particules virales. 1. Les domaines de la Pr55 gag impliqués dans le bourgeonnement viral De nombreuses études ont identifiés certaines régions du précurseur comme déterminantes dans la formation et la libération des virions. La matrice en dehors de son groupement myristoil peut être largement, voire entièrement, délétée du Pr55gag sans perturber l’assemblage et la libération de particules dans le milieu extracellulaire (Lee et al., 1994 ; Reil et al., 1998). Ce résultat est en
