MINISTERE DE L'EDUCATION NATIONALE
30
pages
Français
Documents
2002
Le téléchargement nécessite un accès à la bibliothèque YouScribe Tout savoir sur nos offres
30
pages
Français
Documents
2002
Le téléchargement nécessite un accès à la bibliothèque YouScribe Tout savoir sur nos offres
Niveau: Supérieur
MINISTERE DE L'EDUCATION NATIONALE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE Présenté par : Mathieu PAMPIN Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes ETUDE DE RÉGULATEURS DE L'APOPTOSE CHEZ LA LEVURE Soutenu le 17 octobre 2002 devant le jury suivant : M. BETTAÏEB Ali - Président M. MIGNOTTE Bernard - Rapporteur M. GUIARD Bernard - Rapporteur M. FLEURY Christophe - Examinateur Laboratoire E.P.H.E Université de Versailles-Saint- Quentin, de Génétique Moléculaire et Physiologique U.P.R.E.S.A. 8087, E.P.H.E. Directeur : M. MIGNOTTE Bernard () EPHE Banque de Monographies SVT 1
Voir
MINISTERE DE L'EDUCATION NATIONALE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE Présenté par : Mathieu PAMPIN Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes ETUDE DE RÉGULATEURS DE L'APOPTOSE CHEZ LA LEVURE Soutenu le 17 octobre 2002 devant le jury suivant : M. BETTAÏEB Ali - Président M. MIGNOTTE Bernard - Rapporteur M. GUIARD Bernard - Rapporteur M. FLEURY Christophe - Examinateur Laboratoire E.P.H.E Université de Versailles-Saint- Quentin, de Génétique Moléculaire et Physiologique U.P.R.E.S.A. 8087, E.P.H.E. Directeur : M. MIGNOTTE Bernard () EPHE Banque de Monographies SVT 1
- tca acide
- mort cellulaire
- cellule
- protéine
- contenant du raffinose tbs
- milieu semi-synthétique
- voie physiologique d'élimination des cellules
- levure
- tris-edta temed
MINISTERE DE L’EDUCATION NATIONALE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE Présenté par : Mathieu PAMPIN
Pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes ETUDE DE RÉGULATEURS DE L’APOPTOSE CHEZ LA LEVURE Soutenu le 17 octobre 2002 devant le jury suivant :
M. BETTAÏEB Ali - Président M. MIGNOTTE Bernard - Rapporteur M. GUIARD Bernard - Rapporteur M. FLEURY Christophe - Examinateur
La boratoire E.P.H.E Université de Versailles-Saint-Quentin, de Génétique Moléculaire et Physiologique U.P.R.E.S.A. 8087, E.P.H.E.
Directeur : M. MIGNOTTE Bernard (mignotte@genetique.uvsq.fr)
Résumé
Malgré les avancées spectaculaires réalisées au cours de ces dernières années dans la connaissance des mécanismes moléculaires impliqués dans l'apoptose, notre compréhension du contrôle et de l'exécution du programme de mort reste encore très lacunaire. De nombreuses questions demeurent, notamment en ce qui concernent le mode d'action des protéines de la famille Bcl-2. En effet, la compréhension des événements cellulaires et moléculaires impliqués dans le contrôle de ce processus représente une avancée considérable, tant sur le plan de la recherche fondamentale que dans celui de la perspective de la mise au point de nouvelles thérapies anticancéreuses. Le programme de recherches auquel j'ai participé tente de préciser les modes d'action des protéines de la famille Bcl-2 et à identifier de nouveaux partenaires et/ou régulateurs de leur activité, grâce à l'utilisation d'un système-modèle hétérologue : la levure de boulanger. Les projets du laboratoire s’attachent à caractériser la cascade d'événements qui conduisent la cellule à mourir par apoptose, forme de mort cellulaire physiologique dite programmée. Les méthodes mises en œuvre sont celles de la Biologie Cellulaire et Moléculaire et celles de la Génétique. Dans l'étude de l'apoptose, les modèles classiquement utilisés sont basés sur la culture de cellules de mammifères. Plus récemment, une approche génétique a été mise en œuvre au laboratoire. Elle utilise la levure et la drosophile comme systèmes modèles, afin de caractériser la fonction des produits de gènes de la famille Bcl-2 qui sont au cœur du contrôle de l'engagement dans le processus de mort cellulaire et d'identifier de nouveaux régulateurs de ces protéines. Ces deux modèles ont été choisis compte tenu de la connaissance des séquences complètes du génome et parce qu'ils permettent une approche génétique particulièrement aisée et performante. Mon programme de recherches est basé sur l’utilisation de la levureSaccharomyces cerevisiæ comme outil de l’étude de l’apoptose, dans le but d’isoler de nouveaux gènes régulateurs et de mieux comprendre les mécanismes moléculaires qui caractérisent ce type de mort physiologique. Dans ce travail, je me suis attaché à confirmer que l’expression hétérologue de Bax chez la levure s’accompagne des certains phénotypes observés chez les mammifères (dont l’autophagie) et que la co-expression de protéines anti-apoptotiques Bcl-2 ou Bcl-XL ces phénomènes. J’ai, inhibe également, constaté que les effets de Bax sur la croissance et la viabilité varient en fonction du métabolisme énergétique utilisé par la levure. De plus, j’ai montré que la répression catabolique réprime une ou des protéines impliquées dans la cinétique de mortalité induite par la protéine Bax.
Table des matières
A- INTRODUCTION 1. L’ESOTPOPA:TIONFINIDÉ ET DESCRIPTION 1.1. Définition 1.2. Description 1.2.1. La phase d’induction
1.2.2. La phase effectrice 1.2.3. La phase de dégradation 1.3. Pathologies associées à l’apoptose 2. LES PRINCIPAUX RÉGULATEURS DE L’POPAESOT 2.1. Les caspases 2.1.1. Structure et caractéristiques des caspases 2.1.2. Activation des caspases 2.2. La famille Bcl-2 2.2.1. Domaines d’homologies de la famille Bcl-2 2.2.2. Structure des protéines de la famille Bcl-2 2.2.3. Localisation des protéines de la famille Bcl-2 2.2.4. Mode d’action des protéines de la famille Bcl-2 2.3. La mitochondrie 2.3.1. Modèles de perméabilité mitochondriale 2.3.2. Espèces activées de l’oxygène (EAO) 3. LEVURE ET APOPOTES
Liste des abréviations
Dψm Différence de potentiel électrique transmembranaire ADN Acide désoxyribonucléique Apoptosis inducting factor AIF ANT Adenine nucleotide translocator Apaf-1 Apoptotic protease activating factor-1 ARN Acide ribonucléique ATP Adénine 5’-triphosphate
BH Bcl-2 homology BIR Baculovirus inhibitor of apoptosis repeat BSA Bovine serum albumine CASPASE Cysteinyl aspartase Da Dalton dATP 3’-déoxyadénine 5’-triphosphate DISC Death inducting signaling complex Dox Doxycyline DTT Dithiothreitol EAO Espèce activée de l’oxygène ECL Enhanced chemiluminescence EDTA Acide éthylènediamine FADD Fas associed protein with death domain GFP Green fluorescent protein HE Hydroethidium HEPES Acide 2 (N-hydroxyéthyl)pipérazine-N’-2-éthanesulfonique IAP Inhibitor of apoptosis protein IP Iodure de propidium MAC Mitochondrial apoptosis induced channel PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis PEG Polyéthylène glycole PMSF Phénylméthylsulfonyl fluoride PTP Permeability transition pore PVDF Polyvinlidène difluoride RMN Résonance magnétique nucléaire SD Milieu semi-synthétique contenant du glucose SP Milieu semi-synthétique contenant du lactate Sgal Milieu semi-synthétique contenant du galactose SDS Sodium dodecyl sulfate SLA Sclérose latérale amyotrophique Sraff Milieu semi-synthétique contenant du raffinose TBS Tris-buffered saline TCA Acide trichloroacétique TE Tris-EDTA TEMED N, N, N’, N’-tétraméthyléthylène diamine Tg Temps de génération TNF-α Necrosis Factor Tumor Tris Tris (hydroxyméthyl) aminométhane UAS upstream activating sequence UV Ultra-violet VDAC Voltage dependent anion channel YCA1 Yeast caspase 1 YPD Milieu complet contenant du glucose YPG Milieu complet contenant du galactose
A- Introduction
1. L’apoptose : définition et description
1.1. Définition
Le développement et le maintien des organismes multicellulaires sont assurés par la communication des cellules entre elles. En effet, les cellules perçoivent de nombreux signaux régulant la croissance, la différenciation ou coordonnant l’activité avec les cellules avoisinantes et la mort de la cellule, sans pour autant endommager l’organisme. La mort cellulaire programmée, vise à l’élimination de cellules surnuméraires ou potentiellement dangereuses, comme lors du développement embryonnaire ou plus tard en contribuant au maintien de l’homéostasie tissulaire. La place de la mort cellulaire physiologique au cours du développement des vertébrés est illustrée par la morphogenèse des doigts qui nécessite l’élimination des cellules interdigitales. La mort cellulaire programmée occupe également une place prépondérante lors de la mise en place du système nerveux central pour l’élimination des neurones n'ayant pu établir de connexion et lors de l'élaboration du système immunitaire en faisant disparaître les lymphocytes du “ soi . L’apoptose est une forme de mort cellulaire programmée qui a été définie en 1972 par Kerret al.selon des critères morphologiques. L’apoptose est la voie physiologique d'élimination des cellules qui repose sur un programme génétiquement contrôlé par la cellule et requiert de l’énergie et la synthése de nouvelles protéines. Cette forme de mort cellulaire a longtemps été opposée à la nécrose, qui est une mort cellulaire résultant d’une agression du milieu extérieur. 1.2. Description
La cascade des événements conduisant à l’apoptose peut être décomposée en trois phases caractérisées par des modifications physiologiques ou morphologiques caractéristiques (Kroemeret al., 1995) : - la phase d’induction ; - la phase effectrice ; la phase de dégradation. -
1.2.1. La phase d’induction Les cellules reçoivent en permanence des signaux de mortalité et/ou de survie, dont la sommation conditionne leur devenir. L’induction de l’apoptose résulterait de stimuli intra ou extracellulaires. Pour leur part, les stimuli extracellulaires consistent, par exemple : en l’absence de facteurs de croissance ou de survie, des interactions cellulaires, des lésions physiques, l’anoxie, l’activation de récepteurs membranaires (hormonaux) induisant l’apoptose. La perte de l’intégrité du génome, l’expression d’oncogène sont à l’origine de stimuli pro-apoptotiques intracellulaires. Il faut, certes, noter que chaque stimulus possède une voie d’induction qui lui est singulière ; mais il existe une voie commune effectrice pour l'ensemble des voies d'induction.
1.2.2. La phase effectrice Cette phase médiane se caractérise par des changements physiologiques entraînant, de manière irréversible, la cellule vers sa mort. La machinerie apoptotique se met alors en place par
l'intervention, notamment des protéines de la famille Bcl-2, des caspases et de l’apoptosome.
1.2.3. La phase de dégradation Au cours de cette ultime phase, la cellule subit des modifications morphologiques et moléculaires qui aboutissent à son élimination (Kerret al., 1972). En effet, le cytoplasme, les mitochondries et le noyau se condensent, tout en maintenant leurs intégrités. La membrane externe se retourne, exposant alors des molécules de phosphatidylsérines. On observe un bourgeonnement de la membrane, ainsi que la division du cytoplasme en vésicules (nomméescorps apoptotiques cette façon,) qui seront phagocytées par les cellules avoisinantes. De l’apoptose ne s’accompagne pas de réaction inflammatoire du compte tenu de l’absence contacte entre le contenu des corps apoptotiques et le milieu extracellulaire. Enfin, l’apoptose se caractérise au niveau moléculaire, par une chute du potentiel de membrane mitochondriale (DYm), la production d'espèces activées de l'oxygène, la condensation puis la fragmentation de la chromatine (dans de nombreux modèles, une fragmentation internucléosomique de l'ADN nucléaire de façon régulière, produit des fragments d'une taille multiple de 180 à 200 pb (échelle apoptotique)).
1.3. Pathologies associées à l’apoptose
Des dérèglements de l'apoptose sont à l'origine de nombreuses maladies humaines (Thompson, 1995): son inhibition entraîne certaines maladies auto-immunes (Tan, 1994), une prolifération excessive des cellules (tumeurs) (Burschet al., 1992) alors qu'une activation indue du processus apoptotique engendre la perte de cellules comme dans la pathologie du SIDA (Ameisenet al., 1995), en cas de choc ischémique ou dans certaines maladies neurodégénératives, telles que la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson ou la sclérose latérale amyotrophique (Martinou, 1993 ; Raffet al., 1993). En effet, l'apoptose joue un rôle fondamental à différentes étapes de la carcinogenèse (Evanet al., 1992 ; Symondset al exemple au cours de l'hépatocarcinogenèse, les., 1994). Par cellules initiées ont une activité apoptotique qui compense une activité proliférative intense. Il en résulte une élimination de la plupart des cellules initiées. L'apoptose peut aussi être observée à d'autres stades de la progression tumorale et dans d'autres types de cancers. Le contrôle par les mitogènes de la prolifération cellulaire et de l'apoptose est toujours actif dans les cellules néoplasiques et même dans certaines tumeurs malignes avec toutefois un déséquilibre entre les deux phénomènes. Certains gènes impliqués dans l'apparition des cancers sont maintenant connus pour leur action sur l'apoptose. La protéine oncosuppressive p53 induit l'apoptose dans plusieurs types de lignées transformées (Evan and Littlewood, 1998 ; Shiet al., 1992), probablement en raison de la présence de dommages génétiques (Kuerbitzet al., 1992 ; Loweet al., 1993) et cette activité supprime la croissance et la progression tumoralein vivo(Symondset al., 1994). Les produits de plusieurs oncogènes dontc-myc (Evan and Littlewood, 1998 ; Shiet al., 1992) semblent aussi stimuler ce processus. En effet, la stimulation de la prolifération cellulaire consécutive à l'activation d'oncogènes ou à l'inactivation de gènes oncosuppresseurs est souvent associée à une stimulation de l'apoptose (revue :(Evan and
Littlewood, 1998)). Cet effet pro-apoptotique pourrait être inhibé par l'action d'autres oncogènes, anti-apoptotiques, qui agissent en coopération. Par exemple, le proto-oncogèneBcl 2, impliqué dans la pathogenèse des lymphomes folliculaires et d'autres cancers, peut au contraire bloquer l'apoptose dans différentes lignées transformées (pour revues : (Adams and Cory, 1998 ; Zamzamiet al., 1998)). L'étude de ce gène a révélé qu'il appartient à une famille multigénique dont les membres peuvent inhiber (Bcl 2,Bcl XL
) ou favoriser (Bax
) l'apoptose. Les produits de ces gènes sont au cœur du contrôle de l'engagement dans le processus de mort cellulaire. Par conséquent, l’élucidation des mécanismes moléculaires impliqués dans l’apoptose va être décisive pour la compréhension des maladies associées et l'élaboration de traitements ciblés et efficaces. Trois stratégies thérapeutiques sont envisageables : bloquer la perception du signal de mort ou la capacité d’y répondre ou bien ajouter des signaux contraires. Actuellement, les entreprises pharmaceutiques qui s’intéresse aux maladies neuro-dégénératives axent leurs recherches sur le glutamate dont l’accumulation dans les neurones déclenche un phénomène d’apoptose. Cette recherche a permis la mise sur le marché du Rilutek® seul médicament aujourd’hui disponible contre la sclérose latérale amyotrophique (SLA), et qui agit, entre autres, en bloquant la production de glutamate. L’un des problèmes auxquels se heurte l’industrie pharmacologique est de permettre aux molécules curatives de franchir la barrière hémato-encéphalique. En outre, la culture massive de cellules animales est également parties prenantes dans cette recherche puisqu'elle profitera des retombées pour la production d’anticorps monoclonaux et de protéines recombinées (facteurs de coagulation VIII et IX, érythropoïétine, interférons,
), étant donné que le blocage de l’apoptose par la surexpression de gènes anti-apoptotiques tels queBcl-2 ouBcl-XL permet d’augmenter à lui seul le rendement de production protéique (Ballaet al., 2001 ; Dickinsonet al., 1995).
2. Les principaux régulateurs de l’apoptose
Au cours des dernières années, des avancées spectaculaires ont pu être réalisées dans la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans la mort cellulaire. Chez le nématode Caenorhabditis elegans,l'approche génétique a permis de montrer que les cellules condamnées expriment des gènes qui participent activement au processus d'apoptose (Ced 3, Ced-4) (Ellis and Horvitz, 1986 ; Elliset al., 1991a ; Elliset al., 1991b ; Hengartneret al., 1992 ; Horvitz and Ellis, 1982 ; Yuan and Horvitz, 1992 ; Yuanet al., 1993).Ced-3 est l'homologue d'une famille de gènes codant pour des caspases (cystéine à aspartase) (Patelet al., 1996). Un autre gène,Ced 9, est au contraire capable de bloquer ce processus (Hengartner and Horvitz, 1994a ; Hengartner and Horvitz, 1994b).Ced 9 l'homologue de l'oncogène estBcl 2 appartient à une famille de gènes qui qui inhibent ou stimulent l'apoptose des cellules de mammifères. Le mode d'action des gènes de la famille Bcl-2 reste cependant mal compris et les substrats des caspases réellement impliqués dans l'apoptose, mal définis. ChezC. elegans, l'analyse génétique et la mise en évidence d'une interaction entre les protéines Ced 4 et Ced 9 et entre Ced 4 et Ced 3
montrent que Ced 9 inhibe l'apoptose en maintenant la caspase Ced 3 inactive au sein d'un complexe Ced 4/Ced 3. Une autre protéine, appelée Egl 1 favorise la mort cellulaire en empêchant Ced 9 d'agir (Chinnaiyanet al., 1997a ; Wuet al., 1997a ; Wuet al., 1997b). Les homologues mammaliens de Ced 4 et Egl 1 sont, respectivement, la protéine Apaf 1 et les membres de la sous-famille de Bcl 2 contenant le seul domaine BH3, telle Bik. Toutefois, l'inhibition de l'apoptose par les membres anti-apoptotiques de la famille Bcl 2 semble plus indirect que chez le nématode (Moriishiet al., 1999) L'existence de similitudes de fonctions entre Ced-3,-4,-9 et leurs homologues chez les mammifères et la drosophile (tableau 1) démontre que la mort cellulaire programmée est apparue très tôt dans l’évolution et que les mécanismes de base sont en partie conservés entre les nématodes et l’homme. 2.1. Les caspases
L’homologue de Ced-3 appartient à une famille de protéases : les caspases (“ Cysteinyl Aspartases )(Yuanet al., 1993). A ce jour, quatorze caspases ont été découvertes. Elles sont présentes de façon ubiquitaire dans les cellules, sous forme de zymogènes (procaspases), en absence de signal de mort. 2.1.1. Structure et caractéristiques des caspases La procaspase se compose d’un pro, d’un grand et d'un petit domaine. Lors de l’activation, le prodomaine est libéré, un clivage s’opère entre le grand et le petit domaine qui s’associent en un hétérotétramère de type a2b2. Ces protéases se caractérisent par un site actif comportant un résidu de cystéine et par une spécificité pour des substrats comportant une séquence consensus ayant un résidu aspartique en commun. Le clivage du substrat peut s’accompagner soit d'une perte, soit d'un gain de fonctions. Ce dernier cas se trouve illustré par les caspases dont la particularité est de pouvoir s’auto-activer. 2.1.2. Activation des caspases Le passage de la forme procaspase à celle de caspase peut s’effectuer soit par une forte concentration de zymogène soit par une association à une sous-unité régulatrice, voire par une caspase active. Le premier mécanisme débute par la fixation d’un ligand sur un récepteur membranaire extracellulaire tel que CD95 (Ap-1/Fas) ou TNF-a. Dans le cas de CD95, l’activation du récepteur par Ap-1 permet l’association de protéines FADD (“ Fas-Associed protein with Death Domain ) avec Fas qui permet à son tour de recruter des procaspases-8 ou -10. Cette association de protéines forme le complexe DISC (“ Death Inducting Signaling Complex ). La forte concentration en zymogènes, au niveau des récepteurs, compense leur faible activité en rapprochant les sites de clivage et les sites catalytiques aboutissant, à l’activation des caspases-8 ou -10. Le second mécanisme faisant intervenir une sous-unité régulatrice homologue de CED-4,
l’Apaf-1 (“ Apoptotic Protease Activating Factor-1 ), est déclenchée par de nombreux stimuli létaux tant intra- qu’extracellulaires. La présence dans le cytosol de cytochrome c et d’ATP ou de dATP entraîne un changement de conformation d’Apaf-1 en s’associant à lui, ce qui donne lieu à l’holomérisation d’Apaf-1. La fixation sur le complexe de procaspases-9 aboutit à une structure nomméeapoptosome. Au sein de cette structure, les interactions entre les procaspases et les molécules d’Apaf-1 augmentent très fortement l’activité enzymatique des caspases. Le complexe holomérique Apaf-1 peut également lier la protéine Bcl-XL et ainsi empêcher la liaison et le clivage de la procaspase-9. Les caspases activées par ces deux voies vont à leur tour recruter d’autres caspases, la caspase-8 va effectivement activer la procaspase-3 et, pour l’apoptosome, les caspases-3, -6 et -7. Les caspases-8 et -9 qui sont inductrices ont un rôle très important dans l’apoptose puisqu'elles interviennent dans la transduction et l’amplification des signaux pro-apoptotiques en déclenchant une cascade d’activations de caspases, notamment les caspases exécutrices (caspases-3, -6 et -7) (Liet al., 1997). Celles-ci ont pour cible des protéines intracellulaires, du noyau, du cytosquelette, du réticulum endoplasmique et du cytosol dont le clivage engendre la mort cellulaire.
2.2. La famille Bcl-2
La protéine Ced-9 a pour homologue une famille protéique nommée Bcl-2 (“B-type Cell Lymphoma 2 ), en référence au premier régulateur de la mort cellulaire découvert chez les mammifères (Adams and Cory, 1998). A ce jour, une quinzaines de protéines de la famille Bcl-2 ont été identifiées. Elles sont impliquées dans la régulation positive (pro-apoptotique) et négative (anti-apoptotique) de la mort cellulaire (Antonsson and Martinou, 2000 ; Grosset al., 1999). Parmi les membres anti-apoptotiques, Bcl-2 et Bcl-XL des régulateurs négatifs de la mort cellulaire, sont capables d'empêcher les cellules d'entrer en apoptose induite par différents stimuli et dans un grand nombre de types cellulaires différents (Korsmeyer, 1992 ; Zhonget al., 1993). En revanche, des protéines pro apoptotiques telles que Bax, Bid et Egl-1 induisent ou accélèrent la mort cellulaire.
2.2.1. Domaines d’homologies de la famille Bcl-2 La comparaison des séquences des différents membres a montré qu’il existe quatre domaines conservés dénommés BH (“ Bcl-2 Homology ). Les protéines anti-apoptotiques comportent les domaines BH-1/2/3/4, alors que les protéines pro-apoptotiques possèdent les domaines BH-1/2/3 ou seulement BH-3 et jamais de BH-4 qui caractérise de ce fait les protéines anti-apoptotiques (Kelekar and Thompson, 1998). Des expériences de mutagenèse dirigées sur les domaines BH-1 et BH-2 de Bcl-2 et Bcl-XL, montrent que BH-1 et -2 constituent les zones minimales pour l’interaction physique avec leur homologue pro-apoptotique (en formant des homo- ou des hétérodimères) et leur neutralisation (Sedlaket al., 1995 ; Yinet al., 1992). Dans le cas des protéines pro-apoptotiques Bax et Bak, des expériences similaires de mutation
montrent que le domaine BH-3 est à la fois nécessaire pour maintenir la capacité à former des homo-ou hétérodimères. En revanche, les protéines pro-apoptotiques ne possédant que le domaine BH-3 ne s’associent jamais entre elles, mais peuvent former des hétérodimères avec des protéines ayant les domaines BH-1 et BH-2 (Oltvaiet al., 1993). La délétion du domaine BH-4 de Bcl-2 ou Bcl-XL induit la perte de la propriété anti-apoptotique, sans influencer la capacité à former des dimères. Ce domaine pourrait interagir avec d’autres protéines extérieures à la famille Bcl-2 afin d'assurer la propriété protectrice vis à vis de l'apoptose (comme Raf-1 (Wanget al., 1996), Bag-1 et Apaf-1 (Huet al., 1998)). Remarquons, d'une part que la formation de dimères entre les membres de la famille Bcl-2 ne se fait pas de façon aléatoire. Toutes les protéines apoptotique (qui sont présentes dans chaque modèle de mammifère) seraient capables d’interactions préférentielles entre elles (Sedlaket al., 1995). D'autre part, la régulation de l’apoptose par les membres de la famille Bcl-2 en formant des dimères neutres ne semble pas être le seul mécanisme mis en jeu. Des mutagenèses réalisées sur Bcl-XL montrent qu'en l’absence de liaison avec Bax, la propriété anti-apoptotique est conservée[Pétros et al].
2.2.2. Structure des protéines de la famille Bcl-2 La structure tridimensionnelle de Bcl-XL été analysée par diffraction de rayons X et RMN a (Muchmoreet al., 1996). Elle montre une protéine globulaire riche en hélicesα amphipathiques s’organisant autour de deux hélices centralesα-5 etα-6. les quatre domaines d’homologie BH sont répartis le long des hélices 1 à 7, et une boucle flexible hydrophile. Cette boucle interviendrait dans la régulation des phénomènes de modifications post-traductionnels affectant Bcl-2 et Bcl-XL elle : présente en effet une sérine susceptible d’être phosphorylée, mais le rôle de cette modification dans la régulation de la fonction anti-apoptotique n’est pas encore clairement défini (Itoet al., 1997). Observation intéressante, la proximité spatiale de BH-1, BH-2 et BH-3, et leur organisation à la surface de la protéine en une poche hydrophobe, permet de recevoir le domaine BH-3 de Bak (Sattler et al membres de la familles Bcl-2 sont capables d’adopter deux va dans le sens que les., 1997). Cela conformations lorsqu’un membre anti-apoptotique interagit avec un membre pro-apoptotique : la protéine anti-apoptotique ayant une conformation “ récepteur dans laquelle tous les domaines BH sont recrutés pour former en surface une poche hydrophobe capable d‘interagir le partenaire pro-apoptotique qui expose son domaine BH-3 lorsqu’il est dans sa conformation “ ligand . La détermination des structures tridimensionnelles des membres de la famille Bcl-2 (tels que Bcl-XL, Bcl-2 et Bax) a permis d’établir une homologie de domaines avec ceux des pores de toxines bactériennes. Cette homologie structurelle se trouve corrélée par le fait que ces protéines sont capables,in vitro, de former des canaux ioniques dans les bicouches lipidiques.
2.2.3. Localisation des protéines de la famille Bcl-2 Ced-9, Bcl 2 (Akaoet al., 1994 ; Chenet al., 1989 ; de Jonget al., 1994 ; Hockenberyet al., 1990 ; Janiaket al., 1994 ; Krajewskiet al., 1993 ; Nakaiet al., 1993 ; Nguyenet al., 1993), Bcl-xL (Gonzalez-Garciaet al 1., 1994), Mcl and Studzinski, 1997 ; Yang (Wanget al., 1995), BHRF1
protéine du virus d’Epstein-Barr (Hickishet al et probablement d’autres membres de la., 1994) famille de Bcl-2 sont localisées sur le continuum membranaire qui relie la membrane nucléaire externe, le réticulum endoplasmique et la membrane mitochondriale externe(de Jonget al., 1994 ; Hockenberyet al., 1990 ; Krajewskiet al., 1993 ; Nakaiet al seule une fraction de., 1993). Toutefois Bcl-XLest associée aux membranes. Le ou les mécanisme(s) impliqué(s) dans l’association de Bcl-2 à la membrane ne sont pas clairement défini(s). Ainsi, la délétion de la partie C-terminale de Bcl-2 rend la protéine cytoplasmique (Hockenberyet al., 1990). L’incorporation de la protéine se fait par l’extrémité C-terminale et non par l’extrémité N-terminale (comme c’est le cas pour la majorité des protéines ancrées dans les membranes) (Janiaket al., 1994 ; Nguyenet al., 1993). Des mutants de Bcl-2 ayant perdus la capacité de ce fixer aux membranes sont moins efficace à protéger de l’apoptose et cela dans différents systèmes (Borneret al., 1994 ; Nguyenet al., 1994 ; Zhuet al., 1996), ce qui démontre que l’association de Bcl-2 aux membranes est nécessaire à son activité anti-apoptotique. De plus, il a été montré que l’inhibition de l’apoptose dans des cellules MDCK est identique entre un mutant de Bcl-2 se fixant spécifiquement à la mitochondrie et la protéine non mutée, alors qu’une forme mutée de Bcl-2 ne se liant qu’au réticulum endoplasmique perd cette propriété (Zhuet al., 1996). En revanche la fixation préférentielle d’un mutant de Bcl-2 sur le réticulum endoplasmique dans des fibroblastes de rat sauvegarde mieux ces cellules de l’apoptose que la forme mutée ne pouvant se lier qu’à la membrane mitochondriale. Ces mutants de localisation cellulaire de Bcl-2 révèlent l’existence de différentes voies d’apoptose en fonction du type cellulaire étudié. En association avec la membrane du réticulum endoplasmique, Bcl-2 pourrai être impliquée dans le maintient de l’homéostasie du calcium (Distelhorstet al., 1996 ; Heet al., 1997 ; Lamet al., 1994), et moduler le passage de protéines à travers les pores nucléaires (Ryanet al., 1994). Dans une cellule saine, Bcl-XL est majoritairement localisé dans le cytosol sous forme de monomère (Hsuet al., 1997 ; Hsu and Youle, 1997 ; Wolteret al., 1997). L’induction de l’apoptose va engendrer une relocalisation de Bcl-XL forme la membrane mitochondriale sous vers d’homodimère. L’existence d’une fraction cytosolique de Bcl-XL penser que le domaine C- laisse terminal n’est pas libre d’interagir avec les membranes. Deux hypothèses peuvent alors être posées: soit la partie C-terminale est repliée à l’intérieur de la protéine, soit elle est associée à d’autres protéines cytosoliques qui la masquent. En outre, la délétion de la partie C-terminale entraîne une forte baisse de la capacité à protéger de la mort cellulaire, ce domaine est donc essentiel à Bcl-XL pour sa fonction anti-apoptotique qui ne serait active qu’une fois que la protéine serait associée à une membrane. Pour sa part, Bax existe majoritairement sous forme de monomère inactif dans le cytoplasme des cellules saines (Hsuet al., 1997 ; Hsu and Youle, 1997). Dans un contexte apoptotique, Bax est redirigé vers la membrane mitochondriale. Le domaine C-terminal de Bax constitue un ancrage membranaire et un signal d’adressage au compartiment mitochondrial qui, pourtant serait enfoui dans la protéine inactive et exposé par un changement conformationnel, lui même subi au cours de l’apoptose. Cette hypothèse semble confortée par le fait que la délétion de vingt résidus N-terminaux de Bax produit une protéine constitutivement active et adressée à la mitochondrie (Gopinget al.,
