MINISTERE DE L'EDUCATION NATIONALE
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Niveau: Supérieur
MINISTERE DE L'EDUCATION NATIONALE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE Présenté par Muriel SOLER Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes IMPACT DE LA DISTRIBUTION EN QUASI ESPECES DE LA REGION 5' NON CODANTE DU VIRUS DE L'HEPATITE C ET DE SON EVOLUTION SOUS INTERFERON a SUR LA STRUCTURE DU SITE INTERNE D'ENTREE DU RIBOSOME (IRES). Soutenu le 29 octobre 2001 devant le jury suivant : Pr J.C. Gluckman - Président Pr B. Mignotte - Rapporteur Pr D. Dhumeaux - Examinateur Pr J.M. Pawlotsky - Examinateur Laboratoire de Génétique Moléculaire, Université de Versailles St-Quentin -en-Yvelines 45 avenue des Etats-Unis 78035 Versailles cedex Directeur EPHE (IIIe section) : B. MIGNOTTE () Laboratoire de Bactériologie-Virologie, INSERM U99, Hôpital Henri Mondor, 51 avenue du Maréchal de Lattre de Tassigny 94010 Créteil cedex. Chef de service : Pr C-J SOUSSY Directeur du mémoire : Pr J-M PAWLOTSKY () ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre IMPACT DE LA DISTRIBUTION EN QUASI ESPECES DE LA REGION 5' NON CODANTE DU VIRUS DE L'HEPATITE C ET DE SON EVOLUTION SOUS INTERFERON ALPHA SUR LA STRUCTURE DU SITE INTERNE D'ENTREE DU RIBOSOME (IRES)
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MINISTERE DE L'EDUCATION NATIONALE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE Présenté par Muriel SOLER Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes IMPACT DE LA DISTRIBUTION EN QUASI ESPECES DE LA REGION 5' NON CODANTE DU VIRUS DE L'HEPATITE C ET DE SON EVOLUTION SOUS INTERFERON a SUR LA STRUCTURE DU SITE INTERNE D'ENTREE DU RIBOSOME (IRES). Soutenu le 29 octobre 2001 devant le jury suivant : Pr J.C. Gluckman - Président Pr B. Mignotte - Rapporteur Pr D. Dhumeaux - Examinateur Pr J.M. Pawlotsky - Examinateur Laboratoire de Génétique Moléculaire, Université de Versailles St-Quentin -en-Yvelines 45 avenue des Etats-Unis 78035 Versailles cedex Directeur EPHE (IIIe section) : B. MIGNOTTE () Laboratoire de Bactériologie-Virologie, INSERM U99, Hôpital Henri Mondor, 51 avenue du Maréchal de Lattre de Tassigny 94010 Créteil cedex. Chef de service : Pr C-J SOUSSY Directeur du mémoire : Pr J-M PAWLOTSKY () ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre IMPACT DE LA DISTRIBUTION EN QUASI ESPECES DE LA REGION 5' NON CODANTE DU VIRUS DE L'HEPATITE C ET DE SON EVOLUTION SOUS INTERFERON ALPHA SUR LA STRUCTURE DU SITE INTERNE D'ENTREE DU RIBOSOME (IRES)
- arn
- cycle intra-cellulaire de réplication du virus
- vhc
- cellule
- entrée du virus dans la cellule par endocytose via le récepteur
- protéines virales
MINISTERE DE L’EDUCATION NATIONALE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre
MEMOIRE Présenté par Muriel SOLER Pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes IMPACT DE LA DISTRIBUTION EN QUASI ESPECES DE LA REGION 5’ NON CODANTE DU VIRUS DE L’HEPATITE C ET DE SON EVOLUTION SOUS INTERFERON a SUR LA STRUCTURE DU SITE INTERNE D’ENTREE DU RIBOSOME (IRES). Soutenu le 29 octobre 2001 devant le jury suivant :
Pr J.C. Gluckman - Président Pr B. Mignotte - Rapporteur Pr D. Dhumeaux - Examinateur Pr J.M. Pawlotsky - Examinateur Laboratoire de Génétique Moléculaire, Université de Versailles St-Quentin -en-Yvelines 45 avenue des Etats-Unis 78035 Versailles cedex Directeur EPHE (IIIe section) : B. MIGNOTTE (mignotte@genetique.uvsq.fr) Laboratoire de Bactériologie-Virologie, INSERM U99, Hôpital Henri Mondor, 51 avenue du Maréchal de Lattre de Tassigny 94010 Créteil cedex. Chef de service : Pr C-J SOUSSY Directeur du mémoire : Pr J-M PAWLOTSKY (jean-michel.pawlotsky@hmn.ap-hop-paris.fr) ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre IMPACT DE LA DISTRIBUTION EN QUASI ESPECES DE LA REGION 5’ NON CODANTE DU VIRUS DE L’HEPATITE C ET DE SON EVOLUTION SOUS INTERFERON ALPHA SUR LA STRUCTURE DU SITE INTERNE D’ENTREE DU RIBOSOME (IRES).
Muriel SOLER Soutenu le 29 octobre 2001 Résumé : Le virus de l'hépatite C (VHC) est un virus enveloppé dont le génome est un ARN monocaténaire de polarité positive, comprenant deux régions non codantes situées aux extrémités 5' et 3' et un cadre de lecture ouvert d'environ 9000 nucléotides. La région 5' non codante, de 341 nucléotides, contient les séquences régulatrices de la réplication virale et de la traduction des protéines virales; en particulier une structure tige-boucle très conservée, jouant le rôle de site interne d'entrée du ribosome (IRES) et permettant une traduction des protéines virales sur un mode indépendant d'une coiffe méthylée. Cette région 5' non codante est bien conservée d'une souche de VHC à l'autre. Elle est cependant soumise à quelques variations nucléotidiques, notamment au niveau de l'IRES. Notre étude, basée sur l'utilisation des techniques de RT- PCR, clonage et séquençage, a révélé que la région 5' non codante avait une distribution en quasi espèces, qui se définit comme un mélange complexe et en équilibre instable de variants viraux génétiquement distincts bien qu'apparentés. Ce phénomène avait déjà été observé dans d'autres régions plus variables du génome comme les protéines non structurales NS2, NS3 et NS5A et la région hypervariable HVR1 de la protéine d'enveloppe E2. Le nombre de substitutions nucléotidiques et les distances génétiques intra-échantillons étaient inférieurs à ceux observés dans d’autres régions génomiques du VHC, témoignant des fortes contraintes conservatoires sur la région 5’ non codante. Des mutations compensatoires ont été observées, permettant de maintenir la structure secondaire de l’IRES. Nous avons étudié l'évolution génétique de la distribution en quasi-espèces chez des patients traités par l'interféron a-2a et développant une résistance à cette drogue. Chez cinq des six patients, aucune évolution génétique des quasi espèces n’a été observée après traitement. Chez le dernier patient, la distance génétique inter-échantillon était significativement plus grande que la distance génétique intra-échantillon et l’analyse phylogénique a révélé un regroupement différentiel des variants isolés avant et après traitement, suggérant une évolution significative des populations virales. La structure secondaire de l’IRES était globalement inchangée même si la stabilité de la structure cruciforme du domaine III de l’IRES était sujette à quelques variations. L’évolution génétique, observée chez ce patient, apparaissait non pas liée à la sélection de mutants intrinsèquement résistants à l’interféron a mais à la sélection du génotype minoritaire avant traitement (génotype 1b) chez un patient co-infecté avant traitement par des virus de génotypes 2a et 1b. Mots clés : VHC, région 5' non codante, quasi espèces, IRES, interféron a -2a.
TABLE DES MATIERES
LISTE DES ABREVIATIONS 6 INTRODUCTION 7 REVUE DE LA LITTERATURE 9 1) L'hépatite C : aspects épidémiologiques et cliniques10 2) Caractéristiques virologiques du VHC11 3) Variabilité génétique du VHC : les génotypes14 4) Variabilité génétique du VHC : distribution en quasi espèces 18 5) La région 5' non codante du VHC 22 6) Le traitement de l'hépatite chronique C 25
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LISTE DES ABREVIATIONS
ADN :acide désoxyribonucléique AMV :avian myeloblastosis virus APS :ammonium persulfate ARN :acide ribonucléique ATP :adénosine triphosphate BCC :bouillon cœur-cervelle BHI :brain heart infusion ddNTP :didésoxynucléotide triphosphate DMSO :diméthyl sulfoxide dNTP :désoxynucléotide triphosphate DTT :dithiothréitol EDTA :éthylènediamine tétra-acétique HVR1 :hypervariable region 1 IPTG :isopropylthio-b-D-galactoside IRES :internal ribosome entry site Kb :kilobase LDL :low density lipoprotein LiPA :line probe assay NS5A :non structural region 5A NS5B :non structural region 5B PCR :polymerase chain reaction PTB :polypyrimidine tract-binding protein RFLP :restriction fragment length polymorphism SSCP :single strand conformation polymorphism TBE :tris-borate EDTA VHC :virus de l’hépatite C VIH :virus de l’immunodéficience humaine X-Gal :5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside INTRODUCTION En 1989, l'utilisation des techniques de biologie moléculaire a permis l'identification du virus de l'hépatite C (VHC), responsable de la grande majorité des hépatites "non A-non B" à transmission parentérale (Choo et al, 1989). L'identification du VHC constitue une étape importante dans l'histoire de la virologie, car ce virus a été identifié à partir de son génome, grâce à la biologie moléculaire, sans visualisation préalable de la particule virale en microscopie électronique ou isolement en culture cellulaire. L'hépatite chronique virale C pose un réel problème de santé publique en France en raison du nombre de malades infectés (environ 600 000) et de son caractère volontiers pauci-symptomatique, qui fait que 40 à 50% des patients seulement ont été dépistés. Le risque lié à l'hépatite chronique virale C est l'évolution vers ses complications telles que la cirrhose (environ 20% des cas) ou le carcinome hépatocellulaire, qui survient avec une incidence de 4 à 5% par an chez les malades cirrhotiques. Le traitement par l'interféron a ne permet une clairance virale prolongée que chez une minorité des patients traités. Son association à la ribavirine, traitement de référence actuel, est encore inefficace chez près de 60% des patients traités.
REVUE DE LA LITTERATURE
Une des principales caractéristiques du VHC est sa grande variabilité génétique. Cette variabilité du VHC est plus ou moins marquée selon les régions du génome. Le phénomène de sélection de variants viraux par l'interféron a a été observé dans des régions génomiques variables telles que la région hypervariable HVR1 ou la région non structurale NS5A (Pawlotsky et al, 1998b; Pawlotsky et al, 1999). La région 5' non codante joue un rôle important dans la réplication virale. C'est une région peu variable, dont l’évolution au cours du traitement par l’interféron a n’est pas connue. 1) L'hépatite C : aspects épidémiologiques et cliniques Le virus de l'hépatite C (VHC) est le principal agent étiologique des hépatites non A - non B à transmission parentérale. Après l'infection, une hépatite aiguë survient dans tous les cas, le plus souvent asymptomatique. Dans plus de 80% des cas, l’infection persiste et est responsable d’une hépatite chronique qui peut, à son tour, se compliquer d'une cirrhose (dans environ 20% des cas). L'incidence du carcinome hépatocellulaire (cancer primitif du foie) chez les patients atteints de cirrhose virale C est de l'ordre de 4 à 5% par an (Colombo et al, 1991). Les délais moyens d'apparition de la cirrhose et du carcinome hépatocellulaire sont respectivement de vingt et trente ans après l'infection (Tong et al, 1995). Dans 70 à 80% des cas, la transmission du VHC est parentérale, liée à la transfusion de sang ou de produits dérivés du sang ou à une toxicomanie par voie veineuse. Le risque de transmission post-transfusionnelle a été considérablement réduit, de 6% au début des années 1980 à 1 pour 280 000 dons aujourd'hui (Pawlotsky et Lunel, 1995a). Cette réduction est liée au développement de tests sérologiques de dépistage sensibles et à l'introduction de techniques d'inactivation virale dans la préparation de certains produits sanguins stables. La toxicomanie par voie veineuse reste un mode de transmission difficilement contrôlable. Elle est aujourd'hui la principale source d'infections nouvelles. La transmission sexuelle a été évoquée mais elle concerne probablement une minorité de cas. La possibilité d'une transmission intra-familiale a été suggérée. Elle ne rendrait compte que d'un faible nombre de cas (inférieur à 1%). L’incidence de la transmission mère-enfant est d'environ 5 à 10% chez les mères non infectées par le virus de l'immunodéficience humaine (VIH), mais ce taux atteint 20% chez les mères co-infectées par le VIH. Enfin, la transmission nosocomiale est possible et pourrait être fréquente dans certaines circonstances telles que l'hémodialyse, les soins intensifs, les soins dentaires, la réalisation de biopsies endoscopiques. Chez 10 à 20% des patients, le mode de transmission de l'infection reste inconnu (Roudot-Thoraval et al, 1997). 2) Caractéristiques virologiques du VHC Le virus de l'hépatite C est un membre de la famille des Flaviviridae, récemment subdivisée en cinq genres : les Flavivirus (qui comprennent, par exemple, le virus de la fièvre jaune et les virus de la dengue), les Pestivirus (virus exclusivement animaux), les Hépacivirus (genre aujourd'hui exclusivement représenté par les différents variants du VHC) et les nouveaux Flaviviridae (comprenant le genre du GBV-B et le genre du GBV-A et du GBV-C/VHG (Linnen et al, 1996, Simons et al, 1995)). Le VHC est un petit virus enveloppé de 55 à 65 nm de diamètre. La densité des particules virales varie de 1,03 à 1,72 g/ml en gradient de sucrose. Cette hétérogénéité est due à la circulation des particules virales sous forme de particules libres, infectieuses, de faible densité et de particules associées à des immunoglobulines, non infectieuses, de forte densité. Les particules de faible densité semblent également pouvoir se lier à des lipoprotéines (Thomssen et al, 1992), facilitant ainsi l'entrée du VHC dans la cellule par endocytose. Le génome du VHC est constitué d'un simple brin d'ARN linéaire, de polarité positive, d'environ 10 kb. L'ARN est contenu dans une capside protéique icosaédrique située à l'intérieur d'une enveloppe lipidique, à la surface de laquelle deux glycoprotéines d'enveloppe E1 et E2 sont ancrées sous la forme de complexes hétéro-dimériques liés par des ponts disulfures. Le génome du VHC comprend trois régions : - Une région 5' non codante de 329 à 341 nucléotides. Elle contient des séquences hautement conservées qui jouent un rôle de régulation très important lors de la réplication virale et de la traduction de l'ARN en protéines. Il existe une grande structure tige-boucle à la partie proximale de la région 5' non codante, correspondant à un site interne d'entrée du ribosome (internal ribosome entry site ou IRES) (Tsukiyama-Kohara et al, 1992).
- Un long cadre de lecture ouvert de 9030 à 9099 nucléotides, dont la traduction aboutit à la synthèse d'une polyprotéine précurseur unique de 3010 à 3033 acides aminés clivée secondairement pour donner naissance à des protéines virales structurales et non structurales sous l'action combinée de protéases virales et cellulaires. La protéine de capside C (21 kd) et les deux glycoprotéines d'enveloppe E1 (gp31) et E2 (gp70) constituent les protéines virales structurales. Dans la région codant pour la protéine E2, il existe une région hypervariable (HVR1) située à son extrémité 5' et comprenant 81 nucléotides. C'est une des cibles principales des anticorps neutralisants dirigés contre le VHC (Weiner et al, 1992; Farci et al, 1994). Parmi les protéines virales non structurales NS2 à NS5, NS2 a une fonction métallo-protéase dépendante du zinc qui permet le clivage autocatalytique entre NS2 et NS3. La fonction trypsine-like sérine-protéase de NS3, qui possède également une fonction hélicase impliquée dans le déroulement de l'ARN pour la réplication, permet le clivage des protéines non structurales situées en aval à partir du polypeptide précurseur. La région NS4A code pour un peptide régulateur qui stabilise et facilite l'activité protéasique de NS3 et régule la phosphorylation de la protéine NS5A. Les fonctions des protéines NS4B et NS5A ne sont pas connues précisément. NS5B est l'ARN polymérase dépendante de l'ARN qui permet la réplication du génome (Major et Feinstone, 1997). Le codon stop du cadre de lecture ouvert est précédé d'une structure ARN tige-boucle très stable située à l'extrémité 3' de la région NS5B. Cette structure secondaire pourrait jouer un rôle important dans la terminaison de la traduction, au même titre que l'IRES, située dans la région 5' non codante, dans son initiation (Van Doorn, 1994). - Une région 3' non codante de longueur variable contenant une région dite variable, une séquence poly-uridyle et une séquence conservée de 98 nucléotides, impliquée dans l'initiation de la réplication. Le cycle intra-cellulaire de réplication du virus est mal connu. Il n'existe pas de système de culture cellulaire permettant la production in vitro de particules virales infectieuses et l'étude des mécanismes de la réplication. Un candidat récepteur a été récemment proposé : la tétraspanine CD81 (Pileri et al, 1998). Les protéines d'enveloppe du VHC semblent capables de s'y fixer mais la pénétration du virus par ce biais n'a pas été démontrée. L'hypothèse d'une entrée du virus dans la cellule par endocytose via le récepteur des "low density lipoproteins" (LDL), est également évoquée (Agnello et al, 1999). Après pénétration dans le cytoplasme de la cellule, on suppose, par analogie avec les autres virus à ARN monocaténaire de polarité positive, que l'ARN viral sert de matrice pour la synthèse par l'ARN polymérase virale dépendante de l'ARN de brins d'ARN de polarité négative. Ces brins négatifs vont à leur tour servir de matrice pour la synthèse d'un grand nombre d'ARN de polarité positive, qui seront utilisés comme ARN messagers pour la synthèse de protéines virales dans la cellule ou qui seront encapsidés et enveloppés dans les particules virales néoformées. Le mode de sortie des particules virales hors de la cellule infectée n'est pas connu. Le niveau de réplication du VHC est relativement faible. Le virus se réplique principalement dans les hépatocytes mais il pourrait également se répliquer dans certaines cellules mononucléées du sang périphérique (Muller et al, 1993; Yun et al, 1994; Lerat et al, 1996). 3) Variabilité génétique du VHC : les génotypes Peu après l'identification du VHC, des différences ont été observées entre les séquences nucléotidiques de souches isolées dans différentes régions du monde. Grâce à l'analyse de leurs séquences nucléotidiques complètes, des souches virales de provenances géographiques variées ont pu être classées en groupes, appelés types. L'analyse de régions plus limitées du génome viral a permis d'établir un classement des souches au moyen d'arbres phylogéniques, concordants quelque soit la région étudiée. L'analyse de régions plus variables a permis, à l'intérieur de chaque type, un classement en sous-types (Simmonds et al, 1994). On considère que deux souches virales appartiennent au même sous-type d'un même type si l’identité de séquence nucléotidique entre elles est de plus de 90%. Si elle est de l'ordre de 80%, les souches appartiennent au même type mais à des sous-types différents. En deçà de 70% d’identité, les souches sont considérées comme appartenant à deux types différents (Stuyver et al, 1994). Une classification consensuelle des génotypes du VHC, établie par Simmonds et al (1994), a été adoptée. Il existe six types principaux (numérotés de 1 à 6), subdivisés en nombreux sous-types (1a, 1b, 2a...). On a identifié aujourd'hui plus de 75 sous-types différents du VHC, mais certains prédominent largement chez les sujets infectés. L’émergence des génotypes et des sous-types est un phénomène lié à l'évolution des souches virales, toutes dérivées d'un ancêtre commun. L'ARN polymérase dépendante de l'ARN du VHC est une enzyme dépourvue d'activité correctrice 3'-5' exonucléase ou ''proofreading'' : elle ne peut donc pas corriger les erreurs qui surviennent spontanément sur le génome au cours de la réplication. Si ces erreurs surviennent dans des régions du génome dont la conservation est indispensable à la conservation du caractère infectieux du virus, elles aboutissent à la formation de particules virales défectives et ne sont pas reproduites. Si les erreurs surviennent dans des régions où elles n'empêchent pas la réplication, les virus descendants porteront tous la mutation. Le taux de mutation du génome du VHC a été estimé à environ 10-4 à 10-3 substitutions nucléotidiques par site et par an ; il correspond aux taux habituellement rencontrés pour les virus à ARN, nettement supérieur à celui des virus à ADN. La survenue de ces mutations au cours du temps, leur sélection naturelle et la constitution d'isolats géographiques et épidémiologiques au sein desquels les souches du VHC ont été transmises en ''circuit fermé'', ont ainsi conduit à l'individualisation progressive au cours des siècles des différents génotypes (types et sous-types) du VHC. L’apparition de nouveaux modes de transmission et l’accroissement des contacts entre les populations ont abouti à la diffusion très large de certains d’entre eux à travers le monde. La répartition des génotypes varie selon les zones géographiques : aux Etats-Unis, les génotypes les plus fréquents sont, dans l'ordre, 1a, 1b, 2b, 3a alors qu'au Japon, le type 1b domine, suivit des types 2a et 2b. Le type 4 est prédominant en Afrique et au Moyen Orient. Les types 5 et 6 sont exclusivement observés respectivement en Afrique du Sud et en Chine (Hong Kong). En Europe de l'Ouest, et plus en France, la distribution des est la suivante : 1b à 50% 1a à 25% 3a à 25% 2 4
(Pawlotsky et al, 1995a). Il a été montré, chez les malades ayant une hépatite C, que les génotypes du VHC étaient associés à des modes de transmission de l'infection particuliers. Dans les pays industrialisés d'Europe de l'Ouest, le sous-type 1b, majoritaire, est associé à la transmission transfusionnelle et aux hépatites C de cause inconnue, alors que les toxicomanes par voie veineuse sont principalement infectés par des virus de type 3a (dans 2/3 des cas) et 1a (dans environ 1/3 des cas) (Pawlotsky, 1995b). Les réponses aux traitements par l'interféron a et par l'association interféron a-ribavirine diffèrent également selon le génotype. Les malades infectés par un virus de type 1 (sous-type 1a ou 1b) répondent en effet significativement moins souvent que les malades infectés par un virus d'autre génotype. Chayama et al (1993) ont ainsi testé la sensibilité des différents génotypes à l'interféron a chez 69 patients ayant une hépatite C chronique. Une normalisation partielle ou complète des transaminases survenait dans 55% des cas chez les malades infectés par le génotype 1b et dans 89% des cas chez les malades infectés par d'autres génotypes (principalement 2a et 2b). Takada et al (1993), dans le même type d'étude, ont trouvé un taux de réponse à l'interféron significativement plus bas pour le génotype 1b par rapport aux autres génotypes. Méthodes de génotypage : La détermination du génotype viral repose sur la mise en évidence, dans des régions particulières du génome, de séquences spécifiques des génotypes et des sous-types par des méthodes de biologie moléculaire ou sur la détection d'anticorps spécifiques de génotypes par des méthodes sérologiques. Les premières techniques sont fondées sur l'amplification génique par ''Polymerase Chain Reaction'' (PCR). Son principe est la synthèse, au cours d'une réaction enzymatique cyclique, d'un grand nombre de copies de l'ARN viral, qui deviennent détectables par les techniques usuelles. La PCR permet donc de fabriquer, grâce à des enzymes thermostables comme la Taq DNA polymerase et, aujourd’hui, des polymérases à haute fidélité, des copies de l'ARN viral qui sont des ADN doubles-brins. Les ADN doubles-brins fabriqués lors de la PCR peuvent être détectés soit par électrophorèse et coloration spécifique de l'ADN, soit par hybridation à des sondes spécifiques. La méthode de référence pour la détermination du génotype du VHC est le séquençage du génome suivi de l'analyse phylogénique des séquences obtenues. Les régions le plus souvent étudiées sont les régions C, E1 et surtout NS5B. Plusieurs techniques rapides permettent également d'identifier le génotype : -L'amplification à l'aide d'amorces spécifiques de génotype et de sous-type proposée par Okamoto et al : la première étape consiste en une amplification par PCR du génome viral, après transcription inverse, à l'aide d'une paire d'amorces universelles, c'est-à-dire non spécifiques de type, localisées dans la région codant pour la capside virale ou NS5B. La deuxième étape consiste en une amplification par PCR du produit de la première PCR à l'aide d'une amorce sens universelle et d'une amorce antisens spécifique de génotype. L'amplification du fragment au cours de cette étape dépend du génotype. La présence ou l'absence de produit amplifié en fonction de l'amorce utilisée permet donc son identification (Okamoto et al, 1992). -L'amplification à l'aide d'amorces universelles, la digestion enzymatique et l'étude du polymorphisme de restriction du produit amplifié (RFLP : Restiction fragment length polymorphism) : cette technique proposée par l'équipe de P.Simmonds consiste à réaliser une amplification par PCR à l'aide d'amorces universelles localisées dans la région 5' non codante. Le fragment amplifié est ensuite découpé par des enzymes de restriction. Les coupures se produisent à des endroits différents selon les génotypes en fonction de la présence de séquences spécifiques à ces positions. Après électrophorèse, le profil de migration des fragments de différentes tailles obtenus est caractéristique de chaque génotype (Davidson et al, 1995). -L'amplification à l'aide d'amorces universelles et l'hybridation inverse à des sondes spécifiques de génotypes et sous-types . Cette technique appelée Line Probe Assay (Inno-LiPA HCV) a été mise au point par Innogenetics. La première étape est une amplification par PCR à l'aide d'amorces universelles biotinylées localisées dans la région 5' non codante du génome viral. Le produit amplifié est ensuite hybridé à une membrane de nitrocellulose sur laquelle ont été préalablement déposées en bandes parallèles des sondes oligonucléotidiques spécifiques des principaux types et sous-types. Le fragment amplifié est hybridé au niveau des bandes contenant les sondes spécifiques du génotype viral. La révélation est colorimétrique grâce à un système avidine-biotine couplé à la phosphatase alcaline (Stuyver et al, 1993). 4) Variabilité génétique du VHC : distribution en quasi espèces La survenue d'erreurs durant la réplication, due à l'absence de mécanismes de correction de l'ARN polymérase dépendante de l'ARN, joue également un rôle important dans la diversité génétique du VHC chez les patients infectés. Les paramètres impliqués dans la fréquence de survenue des substitutions nucléotidiques au cours du temps sont le taux de réplication (estimé à environ 1012 virions/jour (Neumann et al, 1998)), le taux de mutations (environ 1,44.10-3 substitutions/site génomique/an), la taille du génome (environ 9400 paires de bases) et l'infectiosité virale (Stuyver et al, 1997). Lors de l'infection aigüe, la survenue rapide de mutations sur le génome du VHC conduit à l'émergence de plusieurs sous-populations virales, qui sont ensuite sélectionnées sur la base de leur adaptation à l'environnement au sein duquel elles se répliquent. Quand l'infection devient chronique, les sous-populations atteignent un état d'équilibre entre une ou plusieurs populations majoritaires et des populations minoritaires. C'est cet équilibre qui définit la distribution en ''quasi espèce'' du VHC. L'équilibre n'est pas immuable : il évolue au cours du temps au gré des modifications de l'environnement au sein duquel la quasi espèce se réplique, soit spontanément, soit sous l'influence de facteurs extérieurs tels que des traitements anti-viraux ou des modifications de l'immunité de l'hôte. La distribution en quasi espèces du VHC a été démontrée par Weiner et al (1991) et par Martell et al (1992). Par définition, les variants majoritaires d'une quasi espèce sont constitués d'un mélange de séquences virales identiques ou très proches qui comprend au moins 10% de la population de la quasi espèce. Les variants minoritaires comprennent moins de 10% de la population de la quasi espèce (Gretch et al, 1997).
Plusieurs paramètres permettent de caractériser les quasi espèces virales : - la complexité génétique mesure le nombre de variants différents au sein d'une quasi espèce virale (Gretch et al, 1997). Celle-ci peut être estimée de façon plus précise par la mesure de l'entropie qui prend en compte à la fois le nombre de populations virales différentes et leurs proportions respectives (Pawlotsky et al, 1998b; Pawlotsky et al, 1999). - la diversité génétique est définie par les distances génétiques moyennes mesurées entre les différentes séquences des variants de la quasi espèce (Gretch et al, 1997). - les relations phylogéniques entre les différents variants de quasi espèce ou entre les variants de quasi espèces isolés à des instants différents de l'infection chez le même individu peuvent également être étudiées par la construction d'arbres phylogéniques (Pawlotsky et al, 1998b; Pawlotsky et al, 1999). La distribution en quasi espèces du VHC pourrait constituer un des principaux mécanismes par lesquels le virus échappe à la réponse immune et établit une infection persistante chez l'hôte dans plus de 80% des cas (Weiner et al, 1992; Farci et al, 1994). Les patients dont les quasi espèces sont les plus complexes semblent par ailleurs plus résistants au traitement par l'interférona (Takeda et al, 1997; Pawlotsky et al, 1998a). Méthodes d'étude de la distribution en quasi espèces du VHC : Il existe différentes méthodes permettant d'analyser les quasi espèces : - Le séquençage après clonage de produits de PCR La détermination des séquences nucléotidiques par le séquençage après clonage des produits de PCR est la méthode de référence pour étudier les variants présents dans une quasi espèce virale. Elle est cependant lourde et peu adaptée à l'étude de grandes séries de malades. - L’électrophorèse en gel de gradient dénaturant ou Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) Des hétéroduplexes composés d'ADN mutant et sauvage sont soumis à une électrophorèse dans un gel en conditions de gradient dénaturant. Le mésappariement à l'endroit de la mutation provoque une modification de la migration due à une température de fusion altérée. Cette méthode détecte environ 50% des mutations ponctuelles dans un fragment de 50 à 1000 paires de base (Mayers et al, 1985, Cariello et al, 1993). - La méthode TGGE (Temperature Gradient Gel Electrophoresis) C'est une technique voisine de la DGGE, où le gradient de dénaturation est remplacé par un gradient de température (Lu et al, 1995). - La méthode des hétéroduplexes ou GSA (Heteroduplex Gel Shift Analysis) Cette technique fut initialement développée par Delwart et al (1994) pour l'étude de la distribution en quasi espèces du VIH. Les séquences d'une région du génome, par exemple la région hypervariable HVR1, sont amplifiées à l'aide d'une PCR nichée. L'ADN amplifié est cloné dans un plasmide et une sonde spécifique est obtenue en marquant au phosphore 32 des séquences HVR1 purifiées d'un clone choisi au hasard. La sonde est hybridée à une série de clones de la région HVR1. Les hybrides sont analysés par électrophorèse dans un gel de polyacrylamide non dénaturant suivie d'une autoradiographie. La sonde hybridée à elle-même forme un homoduplex dont le profil migratoire est caractéristique et sert de référence pour la migration des homo et hétéroduplexes. La sonde hybridée à des séquences non identiques forme des hétéroduplexes dont la migration dans le gel de polyacrylamide est retardée par rapport à celle de l'homoduplex. La distance de migration dans le gel est corrélée au degré de divergence des séquences nucléotidiques par rapport à la sonde. La diversité et la complexité des quasi espèces peuvent ainsi être estimées à partir des profils migratoires obtenus (Gretch et al, 1997). - La technique du polymorphisme de conformation simple brin (SSCP) La séquence cible de l'ADN viral est amplifiée, dénaturée par la chaleur puis rapidement refroidie. Le mélange de molécules d'ADN simple brin résultant est soumis à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions non dénaturantes. Les molécules d'ADN simple brin adoptent chacune une conformation spatiale caractéristique qui dépend de leur séquence nucléotidique, des conditions des solutions tampons et de la température d'électrophorèse. Les différentes molécules d'ADN d'une quasi espèce migrent à des positions différentes dans le gel et ces bandes sont visualisées par une coloration argentique ou au bromure d'éthidium. Le nombre de bandes détecté est le reflet direct du nombre de variants génétiques distincts à l'intérieur d'une population quasi espèce. En d'autres termes, le nombre de bandes est proportionnel au degré de complexité d'une quasi espèce dans les limites de la sensibilité de la technique (Gretch et al, 1997). L'avantage de l'analyse par PCR-SSCP est la possibilité de détection d'une substitution d'une seule base à des positions non connues à l'avance sur le fragment d'ADN cible. Les principaux paramètres affectant la migration sont la densité du gel, le temps de migration, le voltage mais surtout la température de migration : toute variation de température affecte la conformation adoptée par les simples brins d'ADN et, donc, la mobilité
électrophorétique. Un contrôle précis de la température durant la migration électrophorétique assure la bonne reproductibilité de cette technique (Fujioka et al, 1995). La PCR-SSCP est suffisamment sensible pour détecter plus de 90% des mutations ponctuelles d'un fragment d'ADN de 200 paires de bases et plus de 80% pour un fragment de 400 paires de bases (Kurvinen et al, 1995). Malgré toutes les qualités de cette technique, il est à noter que la SSCP permet d'évaluer la complexité génétique mais pas la diversité génétique des quasi espèces qui doit encore faire appel aux techniques de clonage et séquençage (Gretch et al, 1997). 5) La région 5' non codante du VHC La région 5' non codante du VHC contient les séquences les plus conservées du génome. Son haut degré de conservation en fait une région de choix pour la sélection d'amorces utilisées lors de la transcription inverse et de l'amplification de l'ARN du VHC par PCR permettant une excellente sensibilité de la technique en conditions diagnostiques. La région 5' non codante présente, de 5' en 3': - un repli en épingle à cheveux à l'extrémité 5', de 27 nucléotides, qui pourrait jouer un rôle de régulation négative de la traduction des protéines virales (Han et al, 1991). - trois à cinq petits cadres de lecture ouverts (selon les génotypes) non traduits, qui pourraient représenter des reliquats du virus ancêtre (Han et al, 1991). - une structure complexe impliquée dans l'initiation de la traduction du cadre de lecture ouvert unique du VHC (Han et al, 1991). L'initiation de la traduction du génome des Flavivirus est fondée, comme pour les ARN messagers eucaryotes, sur la liaison d'une sous-unité du ribosome à l'extrémité 5' coiffée de l'ARN viral et par le passage des ribosomes sur la séquence de cet ARN. En revanche, la traduction de la polyprotéine du VHC et des Pestivirus semble être initiée par la liaison des ribosomes à un site accepteur situé dans la région 5' non codante et ce, indépendamment d'une coiffe méthylée en 5'. Ce site accepteur est appelé IRES pour ''internal ribosome entry site'' (site interne d'entrée du ribosome) (Tsukiyama-Kohara et al, 1992). La région 5' non codante comprend quatre structures ''tiges-boucles'' principales (I à IV) et un pseudo-noeud qui contribuent à sa structure secondaire complexe. L'IRES occupe pratiquement toute la longueur de cette région. Les contraintes de conservation de la structure secondaire tige-boucle sont probablement responsables de la grande conservation de la séquence de la région 5' non codante. Les structures tiges-boucles semblent interagir directement avec des protéines virales et/ou cellulaires au cours de la réplication et de la traduction des virus à ARN. Ainsi, trois protéines, nommées PTB (polypyrimidine tract-binding proteins) interagissent avec la région 5' non codante et il a été montré que des facteurs associés aux PTB sont nécessaires à une initiation efficace de la traduction. Les protéines cellulaires telles que PTB ou l'antigène La semblent ainsi se lier à l'IRES et faciliter la liaison des ribosomes à cette structure (Ali et Siddiqui, 1995). Il a également été montré que le facteur d’initiation eucaryote 3 (eIF3) se fixait spécifiquement sur l’IRES du VHC ; il joue un rôle essentiel dans le processus d’initiation de la traduction, par reconnaissance directe et spécifique de la sous-unité 40s du ribosome et de eIF3 par la structure tertiaire de l’IRES. Les sites de fixation de eIF3 sur l’IRES sont situés principalement sur la structure cruciforme du domaine III, englobant les sous-domaines IIIa, IIIb et IIIc (Sizova et al, 1998). La traduction de la polyprotéine est initiée par le codon situé au nucléotide 342. Les séquences entourant ce codon maintiennent un état très structuré, notamment le pseudo-noeud. Il semble que le maintien de cet état soit crucial pour la fonctionnalité de l'IRES. Des changements des structures primaire, secondaire et tertiaire de l'IRES affectent en effet la liaison des protéines cellulaires, induisant une diminution de l'efficacité de la traduction (Wang et al, 1994; Yen et al, 1995). Il a été également rapporté que des mutations réduisant la stabilité de la tige-boucle IV ne réduisaient pas l'efficacité de la traduction. Des mutations stabilisant cette tige-boucle provoqueraient au contraire une diminution significative de l'activité IRES (Honda et al, 1996a). L'efficacité de la traduction serait donc inversement dépendante de la stabilité de la boucle IV. Une faible stabilité de la boucle IV permettrait en fait la dissociation en ARN monocaténaire, la fixation de la sous-unité ribosomale 40S et l'initiation de la traduction (Lemon et al, 1997).
6) Le traitement de l'hépatite chronique C C'est en 1986 qu' Hoofnagle et al ont suggéré, pour la première fois, que l'interféron a pourrait avoir une efficacité dans le traitement des hépatites chroniques non A-non B. Les interférons sont des protéines extra-cellulaires impliquées dans la signalisation; elles appartiennent à la famille des cytokines. Elles peuvent être produites à la suite d'infections virales et ont la propriété d'induire dans les cellules un état de résistance à nombre d'entre elles. Elles présentent également des propriétés anti-prolifératives, anti-tumorales et régulatrices de fonctions immunes et de processus de différenciation (Meurs, 1997). L'action anti-virale de l'interféron a résulte de sa liaison à un récepteur membranaire spécifique activant la traduction de divers systèmes enzymatiques qui rendent la cellule plus résistante aux infections virales. C'est ainsi, par exemple, que la stimulation de l'expression de la 2'-5' oligoadénylate synthétase active certaines ribonucléases, en particulier une RNase L capable de détruire les ARN messagers cellulaires et viraux (Zhou et al, 1993).
La PKR ou protéine kinase dépendante des ARN doubles brins est une sérine thréonine kinase cellulaire naturelle. Sa synthèse est induite par l’interféron a. Son activation par des ARN doubles brins provoque son autophosphorylation. La PKR activée phosphoryle à son tour la sous-unité a du facteur d’initiation de la traduction eucaryote eIF2. La phosphorylation de eIF2 inhibe la synthèse protéique et bloque donc la réplication virale (Proud, 1995). L'interféron a induit en fait de nombreux mécanismes anti-viraux, directs et indirects, aboutissant à une dégradation de l'ARN viral intra-cellulaire et à une inhibition de la traduction de l'ARN viral. L'action immunomodulatrice de l'interféron a se traduit par une activation des composants clés du système immunitaire cellulaire, jouant un rôle dans la reconnaissance virale et la prévention de l'infection de nouvelles cellules par le virus. L'interféron a augmenterait ainsi l'activité des cellules NK (Natural Killer), la maturation des cellules T cytotoxiques et l'expression des antigènes HLA de classe I et de la b2 microglobuline à la surface des cellules (Samuel, 1991). Il induit également la synthèse de nombreuses cytokines qui jouent un rôle dans la modulation de la réponse immune dirigée contre le virus. La ribavirine, un analogue nucléosidique de la guanosine doué de propriétés anti-virales contre les virus à ADN et à ARN, est utilisée dans le traitement de l'hépatite C, en association à l'interféron a. Il semble que la ribavirine, seule, n'inhibe que faiblement et de façon transitoire la réplication du VHC (Pawlotsky et al, 2000); elle semble surtout efficace en association à l'interféron a.
Après six à douze mois de traitement par l'interféron a -2a à raison de 3 millions d'unités trois fois par semaine, on estime qu'une réponse virologique soutenue à long terme, caractérisée par la normalisation des transaminases et la négativité de la recherche d'ARN viral six mois après la fin du traitement, est obtenue dans 5 à 20% des cas (Lindsay et al, 1997). La combinaison interféron a-ribavirine est associée à des taux de réponse virologique soutenue de l'ordre de 40% (Poynard et al, 1998; McHutchinson et al, 1998). Les mécanismes de la résistance du VHC à l'interféron a restent mal connus. L'absence de clairance virale définitive semble associée à un niveau élevé de réplication virale au moment où le traitement est institué (Martinot-Peignoux et al, 1995; Pawlotsky et al, 1996), à certains génotypes (génotype 1) (Martinot-Peignoux et al, 1995; Nousbaum et al, 1995). Une faible complexité génétique des quasi espèces virales semble également indispensable à l'obtention d'une réponse virologique soutenue (Pawlotsky et al, 1998a; Pawlotsky et al, 1998b). La résistance au traitement par l'interféron a est caractérisée par la sélection et la diversification ultérieure de variants viraux adaptés aux modifications environnementales liées à l'administration de l'interféron. Celles-ci, démontrées dans plusieurs régions génomiques, telles qu'HVR1 ou NS5A (Pawlotsky et al, 1998b; Pawlotsky et al, 1999) ont pour conséquence une profonde modification de la composition des quasi espèces virales. Il n'est cependant pas démontré que les séquences sélectionnées soient spécifiquement responsables de la persistance de l'infection. Des études structure-fonction sont aujourd'hui nécessaires pour répondre à cette importante question. Le fait que les facteurs prédictifs de réponse à l'association interféron-ribavirine soient les mêmes que les facteurs prédictifs de réponse à l'interféron seul suggère des mécanismes de résistance similaire. Les évènements concernant la région 5' non codante, qui joue un rôle fondamental dans la réplication virale, n'ont pas été étudiés à ce jour. BIBLIOGRAPHIE
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