MINISTERE DE L'EDUCATION NATIONALE
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2001
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Niveau: Supérieur
MINISTERE DE L'EDUCATION NATIONALE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE présenté par ANDRIEU THIBAULT pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes soutenu le 15 Octobre 2001devant le jury suivant : Monsieur le Pr Dominique DORMONT- Président Monsieur le Pr Stéphane RICHARD- Rapporteur Monsieur le Pr Jean-Marie HURAUX- Examinateur Madame le Dr Annie CAHOUR- Examinateur Monsieur le Pr Paul DENY- Examinateur (1) Directeur E.P.H.E. (Sciences de la Vie et de la Terre) : Professeur S RICHARD () Laboratoire de Génétique Oncologique, Faculté de Medecine Paris Sud (63 Rue Gabriel Peri, 94 276 Le Kremlin Bicêtre) (2) Tuteur de recherche EPHE : Docteur Annie CAHOUR () Laboratoire de Virologie du CERVI, Hôpital de la Pitié Salpêtrière, 75013 Paris (Chef de Service : Professeur JM HURAUX ) (3) Etudiant : M. Andrieu Thibault () RESUME L'hépatite virale C représente un problème majeur de santé dans le monde. Elle touche en France trois fois plus de personnes que le VIH ; son évolution est lente et majoritairement asymptomatique au début de l'infection, et son pronostique est souvent mauvais.
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MINISTERE DE L'EDUCATION NATIONALE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE présenté par ANDRIEU THIBAULT pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes soutenu le 15 Octobre 2001devant le jury suivant : Monsieur le Pr Dominique DORMONT- Président Monsieur le Pr Stéphane RICHARD- Rapporteur Monsieur le Pr Jean-Marie HURAUX- Examinateur Madame le Dr Annie CAHOUR- Examinateur Monsieur le Pr Paul DENY- Examinateur (1) Directeur E.P.H.E. (Sciences de la Vie et de la Terre) : Professeur S RICHARD () Laboratoire de Génétique Oncologique, Faculté de Medecine Paris Sud (63 Rue Gabriel Peri, 94 276 Le Kremlin Bicêtre) (2) Tuteur de recherche EPHE : Docteur Annie CAHOUR () Laboratoire de Virologie du CERVI, Hôpital de la Pitié Salpêtrière, 75013 Paris (Chef de Service : Professeur JM HURAUX ) (3) Etudiant : M. Andrieu Thibault () RESUME L'hépatite virale C représente un problème majeur de santé dans le monde. Elle touche en France trois fois plus de personnes que le VIH ; son évolution est lente et majoritairement asymptomatique au début de l'infection, et son pronostique est souvent mauvais.
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MINISTERE DE L’EDUCATION NATIONALE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE présenté par ANDRIEU THIBAULT pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes
soutenu le 15 Octobre 2001devant le jury suivant : Monsieur le Pr Dominique DORMONT - Président Monsieur le Pr Stéphane RICHARD - Rapporteur Monsieur le Pr Jean-Marie HURAUX - Examinateur Madame le Dr Annie CAHOUR - Examinateur Monsieur le Pr Paul DENY-Examinateur (1) Directeur E.P.H.E. (Sciences de la Vie et de la Terre) : Professeur S RICHARD (stephane.richard@kb.u-psud. ) fr Laboratoire de Génétique Oncologique, Faculté de Medecine Paris Sud (63 Rue Gabriel Peri, 94 276 Le Kremlin Bicêtre) (2) Tuteur de recherche EPHE: Docteur Annie CAHOUR (cahour@idf.ext.jussieu.fr) Laboratoire de Virologie du CERVI, Hôpital de la Pitié Salpêtrière, 75013 Paris (Chef de Service : Professeur JM HURAUX ) (3) Etudiant: M. Andrieu Thibault (Thibault.Andrieu@chups.jussieu.fr) RESUME L’hépatite virale C représente un problème majeur de santé dans le monde. Elle touche en France trois fois plus de personnes que le VIH ; son évolution est lente et majoritairement asymptomatique au début de l’infection, et son pronostique est souvent mauvais. L’étude du virus de l’hépatite C est difficile du fait de l’absence de système de culture efficace ; c’est ce qui explique la faiblesse des moyens thérapeutiques dont on dispose et le but de notre travail fondé sur la recherche de marqueurs de l’évolution de la maladie, nécessaires à l’adaptation des traitements.
LISTE DES ABREVIATIONS
Nous avons étudié deux contraintes environnementales : thérapeutique (traitement par l’interféron alpha, qui actuellement est le seul agent antiviral réellement efficace) et biologique (co-infection par le VIH). Pour ce faire, nous avons en premier lieu (i) évalué et précisé le statut sérologique des patients traités, contre la protéine NS5, clivée au cours de la maturation de la polyprotéine en NS5a (impliquée dans les mécanismes de résistances thérapeutique et biologique) et NS5b (qui est la polymérase virale) et (ii) observé un dynamisme au cours du tritement interféron de la séroréactivité contre ces protéines exprimées à l’aide de différents systèmes : eucaryote et procaryote. D’autre part nous nous sommes intéressés au marqueur cellulaire CD26/DPPIV(dipeptidyl peptidase de type IV) présentant une activité enzymatique tout à fait unique et retrouvé sous forme soluble (sCD26/DPPIV) dans les différents liquidies biologiques de l’organisme. Nous avons adapté la méthode de dosage de l’activité enzymatique sérique et/ou plasmatique pour nos patients en microplaque. Notre travail nous a permis de mettre en évidence une réelle évolution du statut sérologique des patients étudiés contre les protéines NS5, NS5a et NS5b. Nous avons déduit des systèmes d’expression envisagés, l’utilité de protéines bactériennes pour une fréquence de détection plus importante. Les protéines d’expression eucaryote se sont au contraire révélées plus performantes dans le suivi du statut sérologique. En ce qui concerne le marqueur sCD26/DPPIV, nous avons démontré pour la première fois, son élévation d’activité sérique, chez les patients infectés par le VHC, sans pouvoir marquer une étape particulière de la maladie. Pour d’autres atteintes virologiques, nous avons pu observer deux composantes de l’élévation d’activité : hépatique et immunitaire, sans pouvoir définir une origine précise de cette augmentation. De plus au cours du suivi de patients co-infectés par le VIH non progresseurs à long terme, nous avons constaté une hausse d’activité sérique DPPIV mais relativement stable dans le temps. aa : acide aminé ADN : Acide Désoxyribonucléique ALAT : Alanine Aminotransférase ARN : Acide Ribonucléique BET : Bromure d’Ethidium CHC : Carcinome Hépatocellulaire DO : Densité Optique ECL : Electrochimioluminescence ELISA : Enzyme Linked immunosorbent Assay HVR : Hyper Variable Region IFN : Interféron IPTG : Isopropyl b D thiogalactoside IRES : Internal Ribosomal Entry Site ISDR : Interferon Sensibility Determining Region kDa : Kilo Dalton ( équivaut à la masse moléculaire apparente ) LB : Luria Broth NR : Non Répondeur
NS : Non Structurale nts : nucléotides PA : Phosphatase Alcaline PCR : Polymeric Chain Reaction Pdb : Paire de bases MSF : enylmethyl Sulfonic Fluoride P Ph PKR : Protéine Kinase dépendante d’ARN bicaténaire : eticulum Endoplasmique RE R R : Répondeur RIBA :Recombinant Immunoblot Assay RR Répondeur avec rechute RT-( PCR ) : Rétro-transcription SAB : Sérum Albumine Bovine SDS-PAGE : Sodium-Dodecyl-Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis TBS : Tris buffer saline TTBS : Tampon Salin Tris Tween VHC : Virus de l’hépatite C I LE VHC 1- Caractéristiques de la particule virale MORPHOLOGIE CLASSIFICATION 2- Organisation génomique 2-1 PROTEINES STRUCTURALES 2-1-1 LA PROTEINE C (CAPSIDE) 2-1-2 LES GLYCOPROTEINES E1 ET E2 2-1-3 P7 2-2 PROTEINES NON STRUCTURALES 2-2-1 LA PROTEINE NS2 2-2-2 LA PROTEINE NS3 2-2-3 LA REGION NS4
TABLE DES MATIERES
2-2-3-1 LA PROTEINE NS4A
2-2-3-2 LA PROTEINE NS4B
2-2-4 LA REGION NS5 2-2-4-1 LA PROTEINE NS5A 2-2-4-2LA PROTEINE NS5B 2-3 LES REGIONS NON CODANTES 2-3-1 LA REGION 5’ NON CODANTE 2-3-1 LA REGION 3’ NON CODANTE 3- Réplication du VHC 4 Génotypes et distribution géographique -4-1 INTRODUCTION 4-2 DISTRIBUTION GEOGRAPHIQUE DES GENOTYPES VHC 5- Quasi-espèces et persistance virale dans la pathogenèse du VHC 5-1 NOTION DE QUASI-ESPECES 5-2 QUASI-ESPECES ET VHC 5-3 ECHAPPEMENT IMMUNITAIRE ET PERSISTANCE VIRALE 6- Histoire naturelle de la maladie 6-1 HEPATITE C AIGUË ET CHRONIQUE 6-2 TRANSMISSION 7- Réponse immunitaire et VHC 7-1 REPONSE IMMUNITAIRE A MEDIATION HUMORALE 7-2 REPONSE IMMUNITAIRE A MEDIATION CELLULAIRE 8- Traitement : l’interféron 8-1 MECANISMES D’ACTION DE L’INTERFERON (ALPHA ET BETA) 8-2 TRAITEMENT II PRESENTATION DU THEME DES TRAVAUX A/ BUT DE L’ETUDE B/ MARQUEURS VIRAUX NS5A, NS5B LA PROTEINE NS5A LA PROTEINE NS5B C/ MARQUEUR CELLULAIRE CD26/DPPIV Caractéristiques de CD26/DPPIV 1- STRUCTURE 2- LIAISONS ET INTERACTIONS
INTERACTIONS AVEC LA MATRICE EXTRACELLULAIRE LIAISON A LA PROTEINE ADA ( ADENOSINE DESAMINASE ) 3- EXPRESSION ET INTERACTIONS BIBLIOGRAPHIE I LE VHC 1- Caractéristiques de la particule virale 1-1 Morphologie Les analyses en microscopie électronique de particules isolées de sérums de patients, d’extraits de foie ou de lignées cellulaires humaines B ou T infectées in vitro par des sérums de patients ont révélé des particules de 50 à 70 nm et d’autres de plus petite taille (45 à 55 nm) . Ces dernières obtenues après traitement par un détergent ou dans les fractions de hautes densités en gradient de sucrose seraient dépourvues du core (protéine C) tandis que les particules de taille plus importante correspondraient aux virions intacts. La densité de la particule varie considérablement d’environ 1,03 à 1,20 g/L . 1-2 Classification Les analyses de séquences du VHC l’ont associé aux membres de la famille des Flaviviridae (Miller et Purcell 1990). Ce sont des petits virions enveloppés dont le génome ARN est traduit en une polyprotéine unique maturée en protéines structurales (S) en partie N terminale suivies des protéines non structurales (NS). Ces caractéristiques ont conduit à considérer le VHC comme nouveau genre de la famille, celui des hépacivirus. Le VHC possède en effet de nombreuses homologies avec les Pestivirus animaux et les Flavivirus humains. 2- Organisation du génome Le virus de l’hépatite C (VHC) fut identifié en 1989 par Choo et ses collaborateurs par les techniques de biologie moléculaire. Il est actuellement, encore impossible de le cultiver de manière efficace, du fait de son faible taux de réplication in vitro , ce qui oblige à extrapoler les résultats obtenus à partir de systèmes d’expression in vitro, à la réalité. Le génome du VHC est constitué d’un ARN simple brin de polarité positive, d’une taille approximative de 9600 nucléotides, variant au travers des différents sous-types viraux. Sa masse moléculaire est voisine de 4000 kDa. L’ARN du VHC contient un seul cadre de lecture ouvert qui code pour une polyprotéine d’environ 3033 acides aminés (aa). Au cours de la traduction, cette polyprotéine est clivée par la combinaison de protéases virales (NS2/NS3 et NS3) et cellulaires (signalases), donnant les différentes protéines de structure, constitutives des virions VHC et les protéines non structurales responsables de fonctions régulatrices. 2-1 Protéines structurales 2-1-1 La protéine C (capside) La protéine C obtenue à partir du clivage de E1, est constituée de 191 aa sous sa forme mature. Elle s’associe au Réticulum Endoplasmique (RE) en une forme p23, maturée ensuite par l’ablation d’une séquence C terminale de 18 aa générant la forme p21. Sa localisation sub-cellulaire est controversée, cependant C est retrouvée de façon prédominante, associée dans le cytoplasme avec des gouttelettes lipidiques. Il semblerait alternativement qu’elle soit trouvée près du noyau et à l’intérieur de celui-ci, de part la présence dans sa région N terminale de 3 acides aminés qui pourraient agir comme des séquences de localisation nucléaire . En plus de sa fonction d’encapsidation, C est capable d’interaction homotypique, formant des multimères, et pourrait exercer une activité de liaison à l’ARN , du fait de sa forte charge positive. Mis à part son rôle structural C possèderait de multiples fonctions du fait de la mise en évidence d’interactions avec différentes protéines. (i) Elle se lie a deux domaines membranaires de la famille des Tumors Necrosis Factors (TNFs), ce qui devrait affecter les fonctions immunes de l’hôte et accroître la mort cellulaire apoptotique (ii) C peut s’attacher aux hn-RNPK (heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K) ce qui pourrait rendre compte de sa capacité à moduler l’expression de gènes
viraux et cellulaires. (iii) une coopération de C avec l’oncogène RAS a été démontrée dans la transformation cellulaire . 2-1-2 Les Glycoprotéines E1 et E2 E1 et E2 sont les deux protéines d’enveloppe du VHC. Elles présentent une masse moléculaire apparente de 31 et 70 kDa respectivement . La résistance de E1 et de E2 à la digestion protéasique, suggère qu’elles sont transloquées dans la lumière du RE . Elles sont néanmoins des protéines intégrales de membranes et sont associées, en complexes hétérodimériques par des interactions non covalentes. . Les glycoprotéines E1 et E2 restent associées de façon prolongée avec la calnexine, une molécule chaperone qui doit les assister lors de leur retenue dans le RE afin de terminer leur repliement. Il y a formation retardée du complexe E1-E2 et rétention dans le RE. La comparaison de séquences a révélé la présence d’une région variable entre les acides aminés 215 et 255 dans E1 et deux régions hypervariables (HVR) dans E2, localisées aux positions 390-410 aa pour HVR1 et 474-480 aa pour HVR2 . Le haut degré de mutation de la région HVR1 est le résultat d’une pression de sélection exercée par le système immunitaire. Il est à noter que des épitopes linéaires ont été trouvés dans HVR1 (E2), cependant les anticorps neutralisants développés ne reconnaissent plus à un stade plus avancé de l’infection ces mêmes épitopes. Ceci s’expliquerait par le haut degré de variabilité de la région N terminale de E2 toléré par le virus qui contient un ou plusieurs épitope(s) important(s) pour la neutralisation et permettrait la sélection de nouveaux variants et donc l’échappement immunitaire du virus. On a pu également montrer que E2 possède un domaine d’homologie de phosphorylation (pePHD) de la PKR (protéine kinase dépendante d’ARN bicaténaire) et d’eIF2 a . E2 réagirait comme un pseudo substrat de la PKR induite par l’interféron, principal traitement actuel, et abolirait la fonction d’inhibition de la traduction par la PKR via l’eIF2 alpha, cible principale lors de l’initiation de la traduction . 2-1-3 p7 Peu de données existent actuellement au sujet de ce polypeptide d’un poids apparent de 7 kDa qui présente plusieurs résidus hydrophobes. Il est clivé inefficacement de la partie C terminale de E2 pour le génotype 1b. Actuellement il est classé dans les protéines structurales avec une ou plusieurs fonctions restreintes à l’environnement de la cellule hôte, qui restent à déterminer individuellement ou dans un complexe E2-p7. 2-2 Protéines non structurales 2-2-1 La Protéine NS2 NS2 est une protéine membranaire de poids moléculaire 23 kDa. Celle-ci contient un domaine cystéine protéase qui, avec la partie N terminale de NS3 forme une protéase zinc dépendante responsable de l’auto-clivage NS2/NS3. . Bien que NS2 puisse posséder d’autres fonctions hormis son rôle dans la maturation de la polyprotéine, aucune autre n’a été mise en évidence jusqu’ici. 2-2-2 La protéine NS3 NS3 est une protéine de 70 KDa qui code pour trois activités enzymatiques : (i) une activité serine protéase , localisée dans le premier tiers N terminal de la protéine et une combinaison en aval, (ii) NTPase / (iii) hélicase . En effet NS3 contient un motif Asp-Glu-Cys-His (DECH dans le code acide aminé à une lettre) entre les positions 1316-1319 de la polyprotéine, qui a été identifié comme un membre de la sous famille DEXH des hélicase DEAD box. NS3 contient aussi un motif Gly-X-Gly-Lys aux positions 1233-1237 identifié comme autre membre de cette famille d’hélicase DEAD box avec une classe d’acides aminés basiques aux positions 1486-1493. Ces activités NTPase et hélicase ont été démontrées grâce à l’expression de NS3 purifiée chez E.coli . Certaines observations ont montré que ce domaine NTPase/hélicase pourrait aussi former un pont avec la séquence poly-U présente dans la région 3’ non codante du VHC. . Néanmoins, la signification de ce pontage poly-U/NS3 sur la stimulation de l’activité NTPase n’est pas certaine à ce jour. NS3 est donc capable de dérouler des duplexes dans la direction 3’-5’ de type ARN/ARN, ARN/ADN et ADN/ADN de façon similaire aux hélicases des autres virus à ARN positifs telles celle des Pestivirus . Enfin outre les fonctions sérine protéase et NTPase/hélicase attribuées à NS3, d’autres fonctions que celles liées à ces activités enzymatiques sembleraient lui être associées, entre les acides aminés 1487 et 1500 (comme un site potentiellement inhibiteur de la PKA et un site d’autophosphorylation localisé dans une sous unité régulatrice de la PKA) ). La moitié N terminale de NS3 a été décrite capable de transformer les fibroblastes de souris NIH 3T3 et d’induire des tumeurs chez la souris nude, sans précision sur le mécanisme impliqué et la pertinence de ce phénomène sur la pathogenèse virale.
2-2-3 La région NS4 2-2-3-1 La protéine NS4a NS4a est un petit polypeptide hydrophobe de masse approximative 8 KDa. Trois principales fonctions lui sont actuellement attribuées : 1. une activation et stabilisation de la sérine protéase NS3 via son domaine central . La région centrale de NS4 semble être requise pour le clivage par la sérine protéase NS3 aux sites NS3/NS4a, NS4b/NS5a et stimule le clivage aux sites NS4a/NS4b, NS5a/NS5b. NS4a doit aussi médier l’association de NS3 à la membrane du RE ce qui peut être important pour la fonction protéase et/ou les diverses fonctions de la réplication de l’ARN. 2. l’ rage de NS3 et peut-être d’autres membres du complexe de réplication aux membranes cellulaires via son anc domaine N terminal hydrophobe . 3. une interaction avec NS5a et la régulation de l’hyperphosphorylation de NS5a . NS4a peut aussi accroître la production de la forme de 58 kDa de NS5a . NS5a migre sous deux formes de poids moléculaires apparents 56 et 58 kDa sur SDS-PAGE. Ces deux formes sont phosphorylées dont une, est hyperphosphorylée (58 kDa), et viendrait de l’association de NS4a avec NS5a . L’implication de NS4a dans l’hyperphosphorylation de NS5a se répercuterait au niveau de la régulation du cycle cellulaire bien que ceci ne soit pas retrouvé pour tout les génotypes. 2-2-3-2 La protéine NS4b Pratiquement rien n’est connu de cette protéine de 27 kDa ou de ces équivalents dans d’autres genres des flaviviridae sinon qu’elle est un composant du complexe de réplication virale. 2-2-4 La région NS5 2-2-4-1 La protéine NS5a NS5a est une protéine clivée après maturation de la polyprotéine, par la protéase NS3. Elle existe sous une forme mature de poids apparent de 56 kDa, mais une forme hyperphosphorylée de 58 kDa a aussi été mise en évidence. NS5a est localisée dans le cytoplasme autour du noyau. Son rôle précis dans la réplication est encore mal connu, cependant on lui a attribué diverses fonctions autres que réplicatives, notamment dans l’inhibition de la résistance cellulaire à l’infection virale via une interaction avec la PKR et la découverte d’une région dénommée ISDR pour région déterminant la sensibilité à l’IFN. Il s’agit d’une région très variable où le nombre de mutations a été associé à la résistance pour le génotype 1b. 2-2-4-2 La protéine NS5b NS5b est une protéine hydrophile de 68 kDa qui contient l’activité ARN polymérase, du au fait de la présence d’un motif GDD (Gly-Asp-Asp) dans sa séquence, caractéristique des polymérases ARN dépendantes des virus à ARN positif. Elle est localisée dans la région périnucléaire, associée aux membranes cellulaires au niveau du RE, où la réplication virale se déroule. 2-3 les régions non codantes 2-3-1 La région 5’ non codante La région 5’ non codante (5’NC), d’une longueur de 341 nucléotides est hautement conservée pour un même génotype et présente quelques variations mineures entre génotypes. Elle possède plusieurs codons AUG en amont du site d’initiation de la traduction et forme une structure ARN complexe qui détient des fonctions régulatrices de la traduction et de la réplication de l’ARN viral. Cette structure est constituée d’éléments de structures secondaires en Tige/Boucle (TB) arrangés en quatre domaines principaux (I-IV) la Tige Boucle IV contenant le codon initiateur AUG . Ces éléments définissent une région IRES ou site interne d’entrée des ribosomes par analogie avec les Picornaviridae. Quand la région 5’ non codante du VHC est placée devant un gène rapporteur en construction mono- ou bicistronique, elle est capable d’initier la traduction du transcrit ARN correspondant sans intervention de coiffe. Plusieurs groupes ont montré que les nucléotides 109 et 119 ainsi que les séquences des TBs sont nécessaires à une traduction ainsi que l’intégrité de leurs structures. Effectivement il a été trouvé que les structures secondaires sont importantes pour la fonctionnalité de l’IRES, car certaines mutations les affectant ont un impact sur son efficacité traductionnelle . De plus il a été rapporté qu’une épingle à cheveux constituée par les 20 premiers nucléotides de la région 5’NC inhibait la traduction .On peut noter que la taille exacte de l’IRES n’est pas exactement définie ; cependant elle commencerait vers le 40 ième nucléotide et s'étenderait aux domaines II à IV. Ainsi la stabilité du
domaine IV a été montrée inversement corrélée avec l’activité IRES . Des expériences de mutagenèse et d’insertion en amont du codon AUG initiateur ont révélé un effet direct sur l’activité IRES, suggérant que le pontage ribosomal est très proche de l’AUG (nucléotides 342-344) donc sans balayage de l’ARN par les ribosomes . Quelques groupes rapportent que la séquence codante en partie N terminale de la capside (12 à 30 nts) serait nécessaire au fonctionnement efficace de l’IRES . Des facteurs cellulaires sont aussi nécessaires au bon fonctionnement de l’IRES, suggéré par différentes découvertes : l’IRES contient une séquence polypyrimidine qui permet la fixation d’une polypyrimidine tract binding protein (PTB) nécessaire à sa fonction ainsi que d’autres facteurs tels que les protéines p25, p87, p120. . 2-3-2 La région 3’ non codante La région 3’ NC du VHC est composée de quatre éléments (i) une séquence courte d’une quarantaine de nucléotides, variable selon le génotype (ii) une séquence poly U (homopolymérique) (iii) une séquence hautement conservée de 98 nucléotides, appelée queue 3’X (hétéropolymérique) dont la localisation à l’extrémité de la région 3’NC et sa conservation suggèrent son importance pour l’initiation de la réplication du brin ARN négatif, (iv) enfin les 45 nucléotides terminaux qui forment une tige boucle très stable . 3- Réplication du virus de l’hépatite C La réplication du VHC est difficile à étudier car il est impossible d’amplifier le virus à l’aide des systèmes de culture cellulaire habituels. Actuellement, du fait de nombreuses analogies avec les flavi- et pestivirus, les spéculations se font à partir du cycle de réplication selon le modèle établi pour la famille des Flaviviridae. Il faut noter que l’ARN viral a été détecté dans le foie de patients infectés par le VHC ou de chimpanzés infectés expérimentalement par des sérums de patients, confirmant que le foie est le site de réplication principal du virus. Actuellement de nombreux arguments sont en faveur de sites de réplication extrahépatiques du VHC tels que les Cellules Mononucléees du Sang Périphérique (PBMC). De nombreuses lignées cellulaires T et B infectées expérimentalement se sont révélées permissives à la réplication virale. Ainsi, un lymphotropisme pourrait rendre compte de nombreux désordres immunologiques, qui serait à l’orignie en particulier, des cryoglobulinémies de type II et III observées dans plus de 50% des patients avec une hépatite C chronique. Utilisant des informations limitées, ces différentes étapes sont brièvement décrites ci-après. Attachement et entrée Récemment l’antigène de surface CD81 a été identifié comme un récepteur possible à la surface cellulaire du fait de sa forte interaction avec E2 ; cependant il serait plutôt impliqué dans l’attachement du virus, son mode d’internalisation restant encore inconnu. Le VHC comme d’autres membres de la famille des Flaviviridae pourrait entrer en liaison avec des récepteurs LDL (" low density particules " : particules de faibles densités). Ceci est basé sur le fait que les particules du VHC sont associées avec les Beta-lipoprotéines analysées et que leur endocytose serait médiée par des récepteurs LDL via les glycosaminoglycanes de type héparanes sulfates. Traduction et maturation de la polyprotéine L’ARN génomique est traduit sous le contrôle de l’IRES. La polyprotéine est directement synthétisée à la surface rugueuse du RE et clivée co- et post traductionnellement par des signalases cellulaires et deux protéases virales (NS2/NS3 et NS3) en formant un complexe stable avec les membranes intracellulaires. Le génome n’étant pas coiffé, la traduction n’est pas médiée par un mécanisme coiffe-dépendant avec un balayage de l’ARN par les ribosomes jusqu’au codon initiateur AUG, mais par sa séquence IRES qui permet l’entrée directe des ribosomes sur l’ARN au niveau du codon initiateur. L’activité de l’IRES est influencée par différents facteurs (i) la queue 3’X (ii) différents facteurs cellulaires comme la PTB (polyprimidine tract binding protein), l’antigène La (ribonucléoprotéine nucléaire hétérogène). Les facteurs cellulaires requis pour l’activité de l’IRES indiquent sa dépendance envers le cycle cellulaire c’est à dire une efficacité accrue en phase G0 (quiescence) ou M0. Réplication de l’ARN Des études de co-précipitations indiquent que tous les produits de clivage de la polyprotéine non structurale du VHC, en particulier NS3-5b forment un complexe de réplication associé aux membranes intracellulaires. La formation d’un tel complexe est une des caractéristiques des virus à ARN positif tels que les picornavirus et les flavivirus . Les étapes individuelles et fondamentales de la réplication de l’ARN sont largement inconnues par manque de modèle cellulaire réplicatif. Il est clair que NS5b (RdRp) joue un rôle clef, catalysant la synthèse d’ARN négatif. En plus des protéines virales, de nombreux composants cellulaires sont probablement impliqués dans la synthèse de l’ARN tels que (i) la PTB qui semblerait interagir avec les régions 5’NC et la 3’NC (ii) la G3PDH (glycéraldehyde-3-phosphate déhydrogénase) qui se fixe à la séquence poly U de la région 3’NC, ainsi que (iii) d’autres protéines cellulaires appelées provisoirement p87 et p130 car non identifiées, mais qui se liraient à la séquence 3’NC. Assemblage du virion et relargage
En absence de système productif de particules VHC, l’assemblage est difficile à étudier. Il s’effectuerait au niveau du RE où les protéines sont retenues pour ensuite être relargué de la cellule par une voie d’exocytose sans traverser l’appareil de Golgi . 4- Génotypes et distribution géographique 4-1 Introduction Le VHC possède une très grande hétérogénéité génétique. On distingue aujourd’hui 6 génotypes (avec de nombreux sous-types, plus de 80) répertoriés et présentant entre eux une homologie de séquence d’environ 70 à 80 % (note : actuellement les génotypes 7,8,9 sont des sous-types du génotype 6 et le génotype 10 un sous-type 3b . Les méthodes les plus communément utilisées pour déterminer le génotype du VHC en pratique clinique sont la "restriction fragment length polymorphism analysis" ou RFLP et la "reverse hybridization line probe assay" ou LiPA d’Innogenetics (Gent, Belgique). L’impact du génotype sur l’évolution de la maladie est controversé, cependant plusieurs travaux décrivent une réponse différentielle au traitement actuel, en fonction du génotype. 4-2 Distribution géographique des génotypes du VHC A travers le monde, les génotypes VHC diffèrent selon la région géographique. Aux Etats-Unis et en Europe, prédomine le génotype 1, plus particulièrement le sous-type 1a pour les USA et 1b pour l’Europe. Les génotypes 2 et 3 sont de plus typiquement retrouvés dans 15 à 30 % de la population Européenne. Le génotype 3 est plus commun dans certaines parties de l’Europe mais aussi en Angleterre, en Thaïlande, en Inde et en Australie. Le génotype 4 est trouvé presque exclusivement dans le middle Est. Le génotype 5 est toujours retrouvé en Afrique du Sud et le 6 est largement représenté à Hong Kong. 5- Quasi-espèces et persistance virale dans la pathogénèse du VHC 5-1 Notion de quasi-espèces L’analyse d’un nombre significatif de clones d’ADNc d’isolats du VHC à partir d’un même patient a prouvé qu’un génome viral responsable de l’infection ne peut pas être défini par une simple séquence, mais par une population de variants de séquence voisine étroitement liés les uns aux autres. Cette organisation de l’information génétique est dénommée quasi-espèces et représente l’une des principales caractéristiques du VHC. En 1971 le Pr Manfred Eigen caractérise le mécanisme de réplication des éléments ARN par sa faible fidélité du "copiage". Dans cette théorie, il définit le concept de quasi-espèces comme un groupe de molécules auto réplicatives, différentes, mais étroitement liées les unes aux autres, qui se développent comme une simple unité, face aux changements d’environnement. Certaines études rejettent la dichotomie classique, entre mutant et type sauvage, comme une compétition entre deux catégories séparées dans l’évolution des virus à ARN. Alternativement tous les variants au regard de leur représentativité dans la population, sont considérés en interaction génétique dynamique. Après une modification de l’environnement, le grand nombre de variants préexistants dans la population originale et les nouvelles populations générées durant la réplication permettront de sélectionner rapidement les mutants les plus favorables pour le nouvel environnement. Les mutants ainsi sélectionnés dans le flot chercheront à nouveau de nouvelles possibilités pour donner une génération continue de mutants progénitures . 5-2 Quasi-espèces et VHC Une des principales caractéristiques du VHC est son hétérogénéité génétique importante résultante de l’accumulation de mutations durant la réplication virale. Génotype et quasi-espèce se réfèrent a un niveau génétique moléculaire ; la différence entre génotypes est de 20 à 30 % sur la séquence nucléotidique complète, tandis que le terme de quasi-espèce représente une variation mineure de la séquence, de 1 à 2% d’hétérogénéité nucléotidique. Le haut degré de mutations caractéristique des virus à ARN peut être attribué aux erreurs de l’ARN polymérase ARN dépendante qui ne possède pas d’activité correctrice permettant l’introduction de mutations nucléotidiques aléatoires sur la totalité du génome viral. De façon analogue aux autres virus à ARN, le VHC circule chez un individu infecté sous forme d’une population de séquences proches mais hétérogènes du même virus : ce sont les quasi-espèces. Des variations extrêmes ont été identifiées principalement dans les glycoprotéines d’enveloppe et en particulier dans la région hypervariable 1 (HVR1) amino terminale de E2. Néanmoins l’hétérogénéité génomique des virus à ARN s’étend au génome entier . A chaque fois qu’une mutation a lieu, elle n’est pas neutre ; en effet lorsqu’un organisme se réplique, c’est qu’il est déjà adapté à son environnement. De nouvelles mutations auraient une tendance à diminuer sa capacité de réplication. Quand au contraire un organisme n’est pas adapté à son environnement, des mutations doivent être avantageuses ce qui résulte en la sélection de nouveaux variants. De plus il a été démontré que la probabilité de mutations avantageuses est grande dans une population qui se réplique faiblement . Les changements dans les populations de quasi-espèces peuvent non seulement résulter de l’émergence de nouvelles souches due à des mutations de novo, mais aussi de fluctuations dynamiques de populations virales préexistantes. Ce phénomène illustre l’infection aiguë par le VHC où de multiples espèces VHC sont transmises simultanément dans l’ inoculum infectieux. En général, les espèces présentes dans l’ inoculum sont en équilibre stable et se répliquent pour un individu donné, la sélection a donc lieu lors de la phase aiguë de l’infection.
5-3 Echappement immunitaire et persistance virale Les mécanismes par lesquels le VHC établit une infection chronique, sont encore inconnus. L’un de ces mécanismes potentiels serait l’existence de quasi-espèces extensives probablement responsables de l’échappement du virus à la réponse immunitaire de l’hôte. Néanmoins, une réponse immune (humorale et cellulaire) est développée contre la plupart des protéines virales mais demeure insuffisante pour éliminer le VHC. Une des principales cibles de l’immunité humorale semble être la glycoprotéine d’enveloppe E2 dans sa partie HVR1 qui contient des épitopes importants de neutralisation . Les virus variants à un temps donné de l’infection, ne sont plus reconnus par les anticorps développés contre les variants précédents, mais peuvent être retrouvés chez un individu infecté. Ainsi les anticorps développés contre la région HVR1 conduisent à une sélection immunitaire d’espèces du VHC et à l’émergence de nouveaux variants que les anticorps développés précédemment ne reconnaissent plus et qui vont induire de nouveaux anticorps, et ainsi de suite. De plus ces anticorps ne sont dirigés que contre des espèces majeures ce qui permet l’échappement d’un certain nombre contre lesquelles aucun anticorps neutralisant n’est élaboré. Certaines études ont de plus démontré que lorsque la diversité des quasi-espèces augmentait lors de la phase aiguë, les patients développaient une hépatite chronique C. Ceci suggère que le système immunitaire de certains patients est plus à même de contrôler le virus que d’autres qui ne l’éliminent pas et le laissent "s’échapper". De façon analogue il a été montré que chez des patients ne présentant pas une réponse immunitaire forte, on avait une diminution de la fréquence des mutations dans l’HVR1 ce qui s’associe à une diminution du nombre de mutants capable de contribuer à l’établissement d’une infection chronique . En ce qui concerne la réponse immunitaire cellulaire développée, deux études ont montré que des CTLs étaient dirigés contre la région NS3 et accentueraient la sélection de variants qui ont un avantage réplicatif pour la persistance chez l’hôte. Dans une autre étude, sur des patients infectés, l’activité des CTLs dirigés contre l’HVR1 est significativement plus élevée chez les patients qui ont éliminé le virus que ceux qui développent une infection chronique et des mutations dans cet épitope n’ont été observées que chez des patients infectés chroniquement. Cependant la réponse immunitaire cible des épitopes multiples et des mutations sont et seront retrouvées sur tout le génome. Ces données ne sont pas entièrement soutenues par tout le monde. Deux chimpanzés infectés après injection intrahépatique de transcrits ARN d’ADNc infectieux (1a) et présentant une infection chronique, possédaient des protéines d’enveloppes E1 et E2 sans changement amino-acidique et sur les deux chimpanzés devenus chroniques, un seul présentait des changements dans l’HVR1 . Ainsi pour ce modèle animal, il apparaît que la pression immune (humorale et cellulaire) contre les protéines d’enveloppes, n’entraîne pas un échappement immunitaire qui puisse être impliqué dans la persistance virale et le développement de la chronicité. Cependant, ceci n’exclut pas que la pression immunitaire puisse s’exercer effectivement sur d’autres protéines virales importantes pour la réplication virale. 6- Histoire naturelle de la maladie La prévalence des infections dues au VHC varie de 1% (pour les pays Occidentaux) à 15% (en Afrique) et parfois plus suivant la zone géographique considérée. L’hépatite C touche 170 millions de personnes dans le monde, dont 500 à 600 000 Français, porteurs chroniques. La primo infection est généralement asymptomatique dans 90% des cas. D’évolution lente, dans environ 80% des cas l’infection débouche sur une chronicité qui conduit à la cirrhose ou au carcinome hépatocellulaire (CHC) sur une période de 20 à 30 ans. Ceci amène en France à la perspective d’une survenue de 30 000 cas de CHC d’ici 10 ans. Il s’agit donc d’une maladie grave de santé publique. 6-1 Hépatites C aiguë et chronique Les formes cliniques asymptomatiques de l’infection observées lors de la primo infection par le VHC déboucent le plus souvent vers la chronicité. Inversement les personnes développant une hépatite aiguë symptomatique (10 %) guérissent spontanément. La période d’incubation de l’hépatite C est généralement de 6 à 7 semaines en moyenne, mais la marge est de 2 à 26 semaines. Les signes cliniques de l’infection aiguë sont apparents dans seulement 30 à 40 % avec développement d’une jaunisse dans seulement 20 à 30 % des cas. Le décès à la suite d’une hépatite C fulminante est rare. L’évolution vers la chronicité touche environ 70 % des personnes présentant une infection aiguë à VHC ; parmi celles -ci environ 85% vont développer une infection persistante donc avec un risque d’évolution lente vers une cirrhose et un cancer du foie. Vraisemblablement la progression apparaît indépendante du génotype ou de la virémie, mais augmente en fonction de facteurs comme la consommation d’alcool, le sexe mâle, un age supérieur à 40 ans de l’infection et la co-infection par les virus VIH ou VHB. Un certain nombre de facteurs pronostiques orientent sur l’issue de la maladie, cependant leur impact dans l’évolution de la maladie n’est pas clairement défini). 6-2 Transmission
Actuellement l’incidence des nouveaux cas est en diminution consécutivement aux nouvelles mesures d’hygiène et de santé prises sur les modes de contamination. La maladie est difficile à enrayer du fait des nombreux problèmes posés lors de l’étude du VHC (i) du point de vue de son étude (inefficacité des systèmes de culture envisagés empêchant tout essai de neutralisation, problème d’utilisation du seul modèle animal : le chimpanzé), (ii) de la nature même de la particule virale : faible taux de réplication au sein de l’individu infecté, variabilité génétique entraînée sous pression de sélection immunitaire de l’hôte, conduisant à une répartition en quasi-espèces du VHC et donc à une adaptabilité de ce dernier à son hôte, ce qui pose le problème de la réponse immunitaire de l’individu contre le virus encore mal connu. Les deux glycoprotéines de l’enveloppe virale (E1 et E2) apparaissent comme les principales cibles pour induire des anticorps neutralisants, cependant des épitopes B et T ont été identifiés sur la plupart des protéines. L’infection est fréquemment associée à des maladies auto-immunes comme la cryoglobulinémie et les atteintes thyroïdiennes (hypo et hyper thyroïdie). Les difficultés d’étude du virus et de mises au point thérapeutiques nécessitent l’amélioration des moyens diagnostiques ainsi que la recherche de facteurs prédictifs d’évolution de la pathologie et de réponse au traitement par l’IFN a qui est actuellement la seule thérapie effective, toutefois de faible efficacité (20 %). Actuellement des résultats encourageants ont été obtenus lors de son association avec la ribavirine concernant les patients de génotype 1b ayant rechuté après IFN a thérapie. 7- Réponse immunitaire et VHC L’hépatite C est une maladie complexe et un problème de santé publique difficile a enrayer du fait d’une mauvaise connaissance des ses propriétés immunologique et de l’absence d’un réel système de production efficace de particules virales. La survenue de l’infection à long terme est difficile à prédire et le virus peut être éliminé ou persister en établissant une infection chronique. Les facteurs qui déterminent ou influencent l’inféction à long terme sont peut connus, bien que certains facteurs apparaissent affecter significativement l’issue de la maladie chez des patients infectés. Les variations extrêmes du VHC observées dans la progression de la maladie expliquent partiellement les différences immunogénétiques. Certaines études suggèrent que la présence de certains gènes HLA peuvent influencer l’issue de la maladie au cours de l’infection et certains haplotypes (HLA DRB1*01, DQB1*0301) ont été associés avec l’élimination de l’infection ou de la clairance virale respectivement. . Les lésions du foie induites par le VHC constituent un mécanisme très complexe à expliquer, toutefois, il est évident que la réponse immune joue un rôle dans ces lésions au cours de l’hépatite chronique. 7-1 Réponse immunitaire à médiation humorale Un certain nombre d’épitopes linéaires de type B ont pu être mis en évidence, cependant il en existe beaucoup d’autres de type conformationnel, difficiles à cartographier. Cependant il est possible d’étudier la réponse immunitaire à l’aide de trousses de diagnostic de troisième et quatrième générations, dont l’intérêt et la comparaison avec d’autres techniques sont discutées plus loin dans cette étude. Actuellement il est admis que les glycoprotéines d’enveloppe sont les seules à induire une réponse humorale neutralisante. Des études in vitro ont pu localiser les épitopes correspondants dans la région hypervariable de E2, cependant ils sont spécifiques d’une quasi-espèce correspondant à la pression immunologique alors exercée. Ces deux points contribuent à l’échappement viral à cette neutralisation par la génération de nouvelles populations de variants, les quasi-espèces de novo alors non neutralisables. 7-2 Réponse immunitaire à médiation cellulaire L’hépatite C aiguë est, dans beaucoup de cas, inapparente et la relation entre l’immunologie de l’infection et la guérison n’est pas bien définie. La réponse immunitaire à médiation cellulaire contribue à l’élimination des cellules infectées par le VHC et à une réponse cellulaire T auxiliaire (Th) généralement associée à la guérison de l’hépatite C aiguë. Les lésions hépatiques sont le résultat de la destruction des hépatocytes par les CTLs principalement par apoptose. Elle est médiée à la fois par un effet cytotoxique direct des CTLs et par relargage de cytokines des cellules CD4 et CTLs de TNF alpha et d’IFN gamma de type Th1 en particulier. 8- Traitement : l’interféron 8-1 Mécanisme d’action de l’interféron (alpha et beta) Les interférons sont des protéines extracellulaires de la super famille des cytokines. Une infection virale peut être à l’origine de leur production, et leurs actions sont diverses. Ils procurent un état de résistance à l’infection de la cellule, mais possèdent aussi des propriétés de régulation de la fonction immune et de la prolifération cellulaire (activité anti-tumorale).Les interférons utilisent la voie de transduction du signal Jack/Stat qui conduit à l’expression/activation de nombreux gènes cellulaires. Les protéines ainsi induites procurent à la cellule diverses propriétés de régulation et de résistance aux pathogènes. Il existe deux types d’interférons : de type I (a / b / w / t ) et de type II ( g ). Ils sont produits par un grand nombre de types cellulaires après stimulation. En Virologie les interférons d’intérêt sont principalement les interférons a , b et g produits principalement par les lymphocytes, fibroblastes et les lymphocytes T helper (Th1) respectivement lors
