Implication des calpaïnes 1 et 3 au cours de la différenciation et de l'apoptose dans un modèle cellulaire, les PC12
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Niveau: Supérieur
MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE Présenté par Isabelle CLERC Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes Implication des calpaïnes 1 et 3 au cours de la différenciation et de l'apoptose dans un modèle cellulaire, les PC12 Soutenu le 30 octobre 2003 devant le jury suivant : Dr. Jean - Michel VERDIER Président Pr. Gérard LEFRANC Rapporteur Dr. Yves BENYAMIN Examinateur Dr. Anne MARCILHAC Examinateur Laboratoire de Motilité Cellulaire (EPHE) UMR 5539 (cc 107), Place E. Bataillon 34095 Montpellier Cedex 05 Directeur du laboratoire: Dr Yves BENYAMIN () Maître de stage : Dr Anne MARCILHAC () ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE IMPLICATION DES CALPAINES 1 ET 3 AU COURS DE LA DIFFERENCIATION ET L'APOPTOSE DANS UN MODELE CELLULAIRE, LES PC12 CLERC Isabelle RESUME EPHE Banque de Monographies SVT 1
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MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE Présenté par Isabelle CLERC Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes Implication des calpaïnes 1 et 3 au cours de la différenciation et de l'apoptose dans un modèle cellulaire, les PC12 Soutenu le 30 octobre 2003 devant le jury suivant : Dr. Jean - Michel VERDIER Président Pr. Gérard LEFRANC Rapporteur Dr. Yves BENYAMIN Examinateur Dr. Anne MARCILHAC Examinateur Laboratoire de Motilité Cellulaire (EPHE) UMR 5539 (cc 107), Place E. Bataillon 34095 Montpellier Cedex 05 Directeur du laboratoire: Dr Yves BENYAMIN () Maître de stage : Dr Anne MARCILHAC () ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE IMPLICATION DES CALPAINES 1 ET 3 AU COURS DE LA DIFFERENCIATION ET L'APOPTOSE DANS UN MODELE CELLULAIRE, LES PC12 CLERC Isabelle RESUME EPHE Banque de Monographies SVT 1
- terminal sequence
- besoin d'hormones spécifiques
- pc12
- développement
- taux intracellulaires de calcium inappropriés
- calpaïnes
- calpaïnes ubiquitaires
- phase terminale dans le développement
- différenciation neuronale
- mort de la cellule par apoptose
MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L’EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE Présenté par Isabelle CLERC Pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes
Implication des calpaïnes 1 et 3 au cours de la différenciation et de l'apoptose dans un modèle cellulaire, les PC12 Soutenu le 30 octobre 2003 devant le jury suivant : Dr. Jean - Michel VERDIER Président Pr. Gérard LEFRANC Rapporteur Dr. Yves BENYAMIN Examinateur Dr. Anne MARCILHAC Examinateur Laboratoire de Motilité Cellulaire (EPHE) UMR 5539 (cc 107), Place E. Bataillon 34095 Montpellier Cedex 05 Directeur du laboratoire: Dr Yves BENYAMIN (benyamin@univ-montp2.fr) Maître de stage : Dr Anne MARCILHAC (marcilhac@univ-montp2.fr) ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE IMPLICATION DES CALPAINES 1 ET 3 AU COURS DE LA DIFFERENCIATION ET L'APOPTOSE DANS UN MODELE CELLULAIRE, LES PC12 CLERC Isabelle RESUME
Les calpaïnes, protéases neutres calcium - dépendantes présentes dans presque tous les types cellulaires, sont impliquées dans un grand nombre de modèles d'apoptose, même si leur rôle exact reste encore à déterminer. La calpaïne 1 est une protéase ubiquitaire, contrairement à la calpaïne 3, isoforme "tissu - spécifique" principalement décrite dans le muscle. Ce diplôme à pour but de déterminer l'implication des calpaïnes 1 et 3 dans la différenciation neuronale et dans trois modèles d'apoptose induite : privation en facteurs de croissance, traitement des cellules à la dexaméthasone (mime les taux élevés de glucocorticoïdes observés lors du vieillissement) et traitement à la ionomycine (ionophore calcique activant préférentiellement les calpaïnes). Nous avons démontré que la calpaïne 1 est localisée préférentiellement avec la filamine et l'intégrine a1ß1 dans les PC12 (cellules issues de phéochromocytome de rat, différentiables en neurones sous pression du NGF) en différenciation et en apoptose, au niveau de certains points clé de la cellule où le cytosquelette est susceptible d'être remanié. La ionomycine entraîne une nette augmentation de l'apoptose et une dégradation complète de la filamine et de la spectrine avec au final une perte totale d'adhérence à la matrice de collagène. Dans ces conditions, l'intégrine s'avère être peu dégradée, suggérant que, dans ce cas, la destructuration de la cellule se fait par perte des liaisons entre les intégrines a1ß1 et le cytosquelette. De plus, nous avons mis en évidence l'effet de la calpaïne sur la protéine proapoptotique Bax. En effet, celle -ci induit le clivage de Bax en tBax et sa translocation à la mitochondrie, menant à la mort de la cellule par apoptose. Cette translocation, lors d'un traitement à la ionomycine, n'entraîne pas le relargage du cytochrome c dans le cytoplasme. La caspase 3 s'avère pourtant être active, suggérant que les calpaïnes, dans ces conditions, peuvent activer directement la caspase 3 sans passer par la voie mitochondriale. La calpaïne 1 peut donc en clivant la filamine et/ou en activant de façon directe la procaspase 3 (qui à son tour pourrait aller cliver la filamine et d'autres protéines cytosquelettiques) induire la mort de la cellule par apoptose. La calpaïne 1 lors de l'apoptose interviendrait donc sur des systèmes protéiques appartenant au cytosquelette (spectrine, filamine), mais également sur des protéines cytosoliques impliquées dans les voies apoptotiques (Bax, caspases). L'activité de la calpaïne 1 peut être diminuée par la mélatonine. La calpaïne 3 quant à elle, a été mise en évidence dans les cellules PC12 à un poids moléculaire de 105 kDa. De plus, nous avons montré que sa translocation nucléaire et son activation étaient régulées par un inhibiteur spécifique des calpaïnes , le MDL28170, après traitement à la ionomycine.In vivochez le rat, la calpaïne 3 est, surexprimée dans l'hippocampe lors d'un stress, en même temps que le facteur de survie Nfkb. Si on soumet ces animaux à des photopériodes différentes, on amplifie ce phénomène chez des rats en photopériode courte, suggérant que la mélatonine pourrait jouer un rôle quant à la protection des neurones vis-à-vis d'agressions physiologiques comme le stress chronique. Mots clés :Calpaïnes, Cytosquelette, Différenciation, Apoptose, PC12, Neurone, Stress, Mélatonine. Introduction générale I. Vie et mort d'un neurone II. Caractéristiques générales de l'apoptose II.1. Généralités II.2. Apoptose et nécrose : quelles différences ? II.3. Pathologies liées à l'apoptose II.3.1.Par un excès d'apoptose II.3.2.Par un manque d'apoptose II.4. Transduction du signal apoptotique II.4.1.La voie cytoplasmique II.4.2.La voie nucléaire II.5. Quelques acteurs moléculaires de l'apoptose II.5.1.Famille Bcl-2 II.5.2.Les caspases III. Les calpaïnes III.1. Généralités III.2. Structure et mécanismes d'activation
III.2.1.Des calpaïnes ubiquitaires III.2.2.De la calpaïne 3, calpaïne "tissu - spécifique" III.3. Fonctions biologiques et substrats : implication dans les phénomènes de différenciation et d'apoptose III.4. Pathologies liées aux calpaïnes IV. Modèles d'étude IV.1. Etudein vitro: les PC12 IV.2. Etudein vivo: le rat stressé chronique IV.3. Deux systèmes hormonaux d'intérêt, les glucocorticoïdes et la mélatonine : pourquoi ce choix? IV.3.1.Les glucocorticoïdes IV.3.2.La mélatonine LISTE DES ABREVIATIONS
6 - OHDA :6 - hydroxydopamine ABP :Actin Binding Protein ADN :Acide Désoxyribonucléique AIF :Apoptosis Inducing Factor ANOVA :Analysis Of VAriance APP :Amyloïd Protein Precursor ARN :Acide Ribonucléique ATP :Adenosine TriPhosphate BDNF :Brain derived Neurotrophic Factor BSA :Bovin Serum Albumin CARD :Caspase Recruitement Domain CDK5 :Cyclin Dependant Kinase 5 DAPI :Diaminophénylindane DEAE :Dyethylaminoethyl DED :Death Effector Domain Dex :ethméonasaxeD DHEA :Déhydroépiandrostérone DISC :Death - inducing Signaling Complex DNA - PK :DNA Protein kinase DO :Densité Optique DTT :Dithiothreitol ECL :Enhanced Chimie Luminescence EDTA :Ethylene Diamine Tetraacetic Acid EGTA: Ethylene Glycol Tetraacetic Acid FADD :Fas Adaptator Death Domain FITC :Fluoresceine Isiothiocyanate GFAP :Glial Fibrillary Acidic Protein GSK3B :Glycogen Synthase Kinase 3ß Htt :Hungtintine
