ETUDE DES ÉTAPES PRÉCOCES DE L'INFECTION PAR UN RÉTROVIRUS : CIBLAGE CENTROSOMAL DU PFV-1 (PRIMATE FOAMY VIRUS TYPE 1)
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Niveau: Supérieur
MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE présenté par Coralie PETIT Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes ETUDE DES ÉTAPES PRÉCOCES DE L'INFECTION PAR UN RÉTROVIRUS : CIBLAGE CENTROSOMAL DU PFV-1 (PRIMATE FOAMY VIRUS TYPE 1) Laboratoire EPHE : Directeur d'études : Pr. Dominique DORMONT Agents Transmissibles Non Conventionnels C.E.A. - Département Recherche Médicale / Service de Neurovirologie 92265 Fontenay-aux-Roses Laboratoire de stage : sous la direction du Dr. Ali SAÏB Pathologie et Virologie Moléculaires Directeur de laboratoire : Pr. Hughes de Thé CNRS UPR9051 / Bât.INSERM – Hôp. St Louis / 75010 PARIS ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE ETUDES DES ÉTAPES PRÉCOCES DE L'INFECTION PAR UN RÉTROVIRUS : CIBLAGE CENTROSOMAL DU PFV-1 (PRIMATE FOAMY VIRUS TYPE 1) Mémoire soutenu EPHE Banque de Monographies SVT 1
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MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE présenté par Coralie PETIT Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes ETUDE DES ÉTAPES PRÉCOCES DE L'INFECTION PAR UN RÉTROVIRUS : CIBLAGE CENTROSOMAL DU PFV-1 (PRIMATE FOAMY VIRUS TYPE 1) Laboratoire EPHE : Directeur d'études : Pr. Dominique DORMONT Agents Transmissibles Non Conventionnels C.E.A. - Département Recherche Médicale / Service de Neurovirologie 92265 Fontenay-aux-Roses Laboratoire de stage : sous la direction du Dr. Ali SAÏB Pathologie et Virologie Moléculaires Directeur de laboratoire : Pr. Hughes de Thé CNRS UPR9051 / Bât.INSERM – Hôp. St Louis / 75010 PARIS ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE ETUDES DES ÉTAPES PRÉCOCES DE L'INFECTION PAR UN RÉTROVIRUS : CIBLAGE CENTROSOMAL DU PFV-1 (PRIMATE FOAMY VIRUS TYPE 1) Mémoire soutenu EPHE Banque de Monographies SVT 1
- protéine lc8
- primate foamy
- interactions entre virus
- protéines virales
- étapes précoces de l'infection
- bases moléculaires de l'interaction
MINISTERE DE LA JUEENSSE,DE L’UCEDIOATN ELANAONTI ET DE LA EERCHHCER ECOLE EITUQPRA DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE présenté par Coralie PETIT Pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes
ETUDE DES ÉTAPES PRÉCOCES DE L’INFECTION PAR UN RÉTROVIRUS: CIBLAGE CENTROSOMAL DUPFV-1 (PRIMATEFOAMYVIRUS TYPE1) Laboratoire EPHE:Directeur d’études: Pr. Dominique DORMONT Agents Transmissibles Non Conventionnels C.E.A. - Département Recherche Médicale / Service de Neurovirologie 92265 Fontenay-aux-Roses Laboratoire de stage:sous la direction duDr. Ali SAÏB Pathologie et Virologie Moléculaires Directeur de laboratoire : Pr. Hughes de Thé CNRS UPR9051 / Bât.INSERM Hôp. St Louis / 75010 PARIS ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE ETUDES DES ÉTAPES PRÉCOCES DE L’INFECTION PAR UN RÉTRSUVORI: CIBLAGE CENTROSOMAL DUPFV-1 (PRIMATEFOAMYVIRUS TYPE1) Mémoire soutenu
par Coralie PETIT De nombreux pathogènes intracellulaires ont développé des mécanismes spécifiques dans le but de détourner à leur seul profit les systèmes cellulaires. Par exemple, certains virus, comme le virus herpès ou le virus de la vaccine, utilisent le cytosquelette pour leur déplacement au sein de la cellule. Néanmoins, le rôle du cytosquelette dans la réplication des rétrovirus reste peu exploré. Il a préalablement été montré que la réplication du rétrovirus complexe PFV-1 (Primate Foamy Virus type 1), le prototype des virus foamy, nécessite un réseau microtubulaire intact : lors desétapes précoces de l’infection, le virus cible le centrosome avant l’import nucléaire du génome viral (Saïb et al., 1997). Dans cette étude ayant pour but de préciser et définir le rôle des microtubules dans le cycle réplicatif du PFV-1, nous montrons que, lors de l’infection, les protéines virales atteignent le centrosome sous forme de capsides entières et structurées. Or, la protéine structurale Gag, composant majeur des capsides, est capable de cibler seule la région péri-centrosomale, hors contexte viral. L’analyse de la distribution sub-cellulaire d’une protéine de fusion GFP-Gag et de différents mutants de cette protéine, révéle que ce ciblage nécessite un domaine de 30 acides aminés formant un motif coiled-coil localisé dans la région N-terminale de la protéine Gag, entre les acides aminés 150 et 180. L’utilisation du nocodazole, drogue qui dépolymérise les microtubules permet de confirmer l’implication du réseau microtubulaire dans ce ciblage. De plus, l’adressage de cette protéine au centrosome fait intervenir une protéine cellulaire associée aux microtubules, appartenant au complexe de la dynéine, la protéine LC8. En effet, des études d’immunofluorescence et de co-immunoprécipitation ont permis de mettre en évidence une interaction directe entre les protéines Gag et la chaîne légère LC8 de la dynéine. Cette étude renforce la notion d’implication du réseau microtubulaire lors des étapes précoces de la réplication d’un rétrovirus complexe (VIH-1 : McDonald et al., 2002), et fait de LC8 la première protéine cellulaire reconnue comme partenaire de la protéine Gag d’un rétrovirus. MOTS CLES:Rétrovirus, Cytosquelette, Spumavirus, Centrosome
ABREVIATIONS 5
LISTE DES FIGURES ET DOCUMENTS ANNEXES
PREAMBULE / AVANT-PROPOS 2
INTRODUCTION 3 A- LESVIRUSFOAMY 3 1- Classification des rétrovirus 3 2- Historique des Spumaretrovirus 4
3- Morphologie et génome 6 4- Les protéines virales et les spécificités des virus foamy 7 5- Cycle viral 11 B- LECTOSQYETTELEU 13 1- Les microfilaments 13 2- Les filaments intermédiaires 15 3- Les microtubules 15 4- Le centrosome 17 5- Dynamique des microtubules 18 6- Les moteurs microtubulaires 19 7- Interactions inter-réseaux 21 C- INSIOCTARETN ENTRE VIRUS ET TTETOSQUELECY 21 1- Le réseau d’actine 22 2- Le réseau microtubulaire 22 D- PROJET DE RECHERCHE 1- Questions en suspens : Interactions entre virus et cellule hôte 2- Situation à l’arrivée au laboratoire 3- Plan de l’étude
MATERIEL ET METHODES 1- Cellules et conditions de culture 2- Obtention et titrage des lots viraux / Infection de cellules 3- Construction des mutants 4- Transformation et mini-préparations d’ADN 5- Transfection 6- Immunofluorescence (IF) 7- Western Blot (WB) 8- IP-WB 9- Transcription/traduction coupléesin vitro 10- Anticorps utilisés 11- Microscopie électronique 12- Tampons utilisés
RESULTATS A- RAPPEL DES RÉSULTATS DU TOIRBORAALE B- GAG HORS CONTEXTE VIRAL C- AGRESOME D- SÉQUENCE MINIMALE E INIOCTRATEN AVEC LES PROTÉINES DES MOTEURS ITCURBOULAIMRES -1- Utilisation de drogues spécifiques 2- Utilisation de protéines « dominants négatifs » 3- Détection d'une co-localisation par immunofluorescence
