Etude de la résistance de Venturia inaequalis à différentes familles chimiques de fongicides
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2004
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Niveau: Supérieur
MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la vie et de la terre MEMOIRE Présenté par Johann Confais Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes Etude de la résistance de Venturia inaequalis à différentes familles chimiques de fongicides soutenu le 3 décembre 2004 devant le jury suivant : Carcaillet Christopher – Président Cordier Geneviève - examinateur Debaud Jean-Claude - examinateur Micoud Annie - examinateur LABORATOIRE EPHE : INTERACTIONS CELLULAIRES RETROVIRUS ET CANCER Adresse : UMR 754 INRA UCBL ENVL Université Claude Bernard 50, avenue Tony LABORATOIRE DE STAGE : LABORATOIRE RÉGIONAL DE LA PROTECTION DES VÉGÉTAUX Adresse : 165, avenue Garibaldi 69003 LYON EPHE Banque de Monographies SVT 1
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MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la vie et de la terre MEMOIRE Présenté par Johann Confais Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes Etude de la résistance de Venturia inaequalis à différentes familles chimiques de fongicides soutenu le 3 décembre 2004 devant le jury suivant : Carcaillet Christopher – Président Cordier Geneviève - examinateur Debaud Jean-Claude - examinateur Micoud Annie - examinateur LABORATOIRE EPHE : INTERACTIONS CELLULAIRES RETROVIRUS ET CANCER Adresse : UMR 754 INRA UCBL ENVL Université Claude Bernard 50, avenue Tony LABORATOIRE DE STAGE : LABORATOIRE RÉGIONAL DE LA PROTECTION DES VÉGÉTAUX Adresse : 165, avenue Garibaldi 69003 LYON EPHE Banque de Monographies SVT 1
- sensibilité de venturia inaequalis
- résistance
- technique d'identification de la mutation g143a
- obtention du matériel mycélien en culture monospore
- visualisation des fragments d'adn par électrophorèse
- développement mycélien
- pommier
MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L’EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la vie et de la terre MEMOIRE Présenté par Johann Confais Pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes Etude de la résistance deVenturia inaequalisà différentes familles chimiques de fongicides soutenu le 3 décembre 2004 devant e jury suivant : l Carcaillet Christopher Président Cordier Geneviève - examinateur Debaud Jean-Claude - examinateur Micoud Annie - examinateur LABORATOIRE EPHE: INTERACTIONS CELLULAIRES RETROVIRUS ET CANCER Adresse: UMR 754 INRA UCBL ENVL Université Claude Bernard 50, avenue Tony
LABORATOIRE DE STAGE: LABORATOIRE RÉGIONAL DE LA PROTECTION DES VÉGÉTAUX Adresse: 165, avenue Garibaldi 69003 LYON
ECOLE PRATIGQarnUierE DES HAUTES ETUDES 69007 LYON Directeur de laboratoire: SCIENCED iDrEe ctLeAu rVIE ET DE LA TERRE Mme Micoud.d’études: Mme Cordier ETUDE DE LA RÉSISTMaAîtNreCdEeDEVENTURIA INAEQUALISÀ DIFFÉRENTES FAMcBIoeLlnlfLaétEroenSn ceC:HMImMeIQUES DE FONGICIDES Johann Confais La lutte contre la tavelure du pommier met en jeu de nombreux traitements fongicides chaque année. Le problème de l’utilisation régulière de ces produits est la sélection de souches fongiques résistantes de l’agent responsable de la tavelure,Venturia inaequalis. Notre objectif a donc été de tester diverses méthodes afin d'estimer le facteur de résistance de la tavelure du pommier, dans différentes régions de France, à différentes classes de fongicides comme les produits de contact, les anilinopyrimidines et les strobilurines. Le premier aspect du travaila consisté à définir la sensibilité de base de souches et de populations n’ayant jamais reçu de traitements, dites« sensibles », en utilisant deux méthodes : le développement mycélienin vitro la et germination de sporesin vitro. Ces tests ont ensuite été appliqués à des souches et des populations de vergers présentant des échecs de traitements. Un protocole de détection de la mutation G143A responsable de la résistance deVenturia inaequalisaux strobilurines existe, cependant cette méthode est gardée sous secret par les firmes phytosanitaires qui l'utilisent. Il nous a paru alors nécessaire de développer également une méthode de biologie moléculaire permettant l'identification de cette mutation. Cette étude a permis de mettre en évidence une forte implantation de la résistance deVenturia inaequalis isoléset Garonne et quelques autres cas strobilurines dans le Tarn aux dans d’autres départements. Les produits de contact et les anilinopyrimidines n’ont pas présenté de dérive de sensibilité. Ces résultats ont permis d’ajuster les recommandations de traitements phytosanitaires faites aux arboriculteurs. La technique d’identification de la mutation G143A mis au point nous permettra de contrôler les résultats avancés par les firmes et de pouvoir estimer la résistance dans les parcelles où les tests biologiques ont échoué. Mots clés :Venturia inaequalis, fongicide, résistance, mutation G143A. TABLE DES MATIÈRES SYNTHÈSE BIBLIOGRAPHIQUE................................. .................................................................5 I. Pommes et pommiers.............................................................................................................. 5
1. La production de pommes dans le monde................................................................................ 5 2. Classification botanique du pommier...................................................................................... 6 3. Stades phénologiques du pommier......................................................................................... 7 4. Génomique du pommier....................................................................................................... 7 II. Les maladies cryptogamiques du pommier............................................................................... 8 1. La tavelure du pommier....................................................................................................... 8 2. Les autres maladies cryptogamiques du pommier.................................................................... 10 III. La lutte contre la tavelure du pommier :............................................................................... 12 1. La lutte biologique.................. .......................................................................................14 2. La lutte génétique......................................... .................................................................14 3. La lutte chimique.............................................................................................................. 17 IV. La résistance aux fongicides............................................................................................... 20 1. Les différents concepts de la résistance aux fongicides.................................... .......................21 2. Aspects populationnels de la résistance aux fongicides............................................................. 22 3. Les phénomènes de résistance au cas par cas :......................................................................... 23 V. Gestion de la résistance par les partenaires institutionnels et privés :........................................ 26 1. la Protection des Végétaux (SPV) :.................................................................... 26Le Service de 2. Les firmes phytosanitaires :.................................................................... .........................28 VI. Objectif du travail............................................................................................................. 28 MATÉRIEL ET MÉTHODES......................................................... 1. Réception des échantillons........................................................... 2. Prélèvements de spores et mise en suspension.................................. 3. Prélèvement des taches de tavelure sur feuilles de pommier................ 4. Obtention du matériel mycélien en culture monospore....................... 5. Obtention de nouvelles spores par fructificationin vivo...................... 6. Test de résistancein vitroaux fongicides........................................ 7. Extraction et purification de l’ADN................................................ 8. Amplification du fragment d'ADN portant la mutation G143A............ 9. Digestion des produits PCR par l’enzyme de restriction..................... 10. Visualisation des fragments d’ADN par électrophorèse................... 11. Analyse des résultats................................................................ RÉSULTATS................................................................................. I. Sensibilité de Venturia inaequalis à différents fongicides en test de croissance mycélienne 1. référence de la tavelure du pommier en test de croissance mycélienne à différentsDéfinition de la sensibilité de fongicides 2. Sensibilité aux produits de contact................................................. 3. Sensibilité aux anilinopyrimidines................................................. 4. Sensibilité au strobilurines........................................................... II. Sensibilité de Venturia inaequalis à différents fongicides en test de germination des spores 1. Mesure du taux de germination de l'ensemble des échantillons............ 2. référence de la tavelure du pommier en test de germination de spores à différentsDéfinition de la sensibilité de fongicides 3. Sensibilité aux produits de contact................................................. 4. Sensibilité aux anilinopyrimidines................................................. 5. Sensibilité aux strobilurines......................................................... III. Optimisation d’une technique d’identification de la mutation G143A... 1. Contrôle de la spécificité de l’amplification avec PS1/PR1................. 2. Optimisation de l’extraction d’ADN à partir de spores....................... 3. Optimisation des conditions de la digestion parSatI........................ 4. Détermination du seuil de sensibilité du test.................................... IV. Présence de la mutation G143A et résistance aux strobilurines........... 1. Contrôle des vergers présentant de la résistance en germination des spores avec cette méthode
2. Corrélation de la sensibilité aux strobilurines en germination de spores avec la présence de la mutation G143A DISCUSSION................................................................................. CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES............................................. BIBLIOGRAPHIE........ ...............................................................................................................29 ANNEXES...................................................................................... Listes des abréviations ABC : ATP Binding Cassette ADN : Acide Désoxyribo Nucléique ANP : Anilinopyrimidine ATP : Adénosine Tri-Phosphate BET : Bromure d’Ethidium CI 50 : Concentration inhibitrice de 50% EDTA : Etylen Diamine Tetracetic Acid FR : Facteur de résistance HR : Humidité Relative IBS : Inhibiteurs de la Biosynthèse des Stérols IDM : Inhibiteur de la 14α-DéMéthylase NADH : Nicotinamide Adénine Dinucléotide Hydrogénée pb : paire de base PCR : Polymerase Chain Reaction PDA : Potato Dextrose Agar pH : potentiel Hydrogène PR-protéines : Pathogenesis Related proteines QoI : fongicides inhibiteurs du site Qo du cytochrome b RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphisms rpm : rotation par minute SRPV : Service Régional de la Protection des Végétaux TBE : Tris-Borate-Etylen diamine tetracetic acid UV : Ultra Violet Synthèse bibliographique I Pommes et pommiers 1 La production de pommes dans le monde La pomme est le premier fruit cultivé et consommé en France et elle est le deuxième fruit échangé
dans le monde après la banane. Les variétés Delicious Rouges et Golden Delicious sont prépondérantes dans le monde et en Union Européenne alors qu'en France ce sont les Golden Delicious et Gala qui dominent. Mais d’autres variétés ont connu une forte croissance mondiale, notamment Fuji (fortement implantée en Chine) et Gala. Cette évolution en faveur des variétés bicolores devrait se poursuivre selon des estimations établies par l’Université de Washington. Fin 2001, la production mondiale de pommes était estimée à 60 millions de tonnes environ, alors qu'elle n'était que de 40 millions de tonnes en 1992. Cette augmentation résulte essentiellement de la montée en puissance chinoise et plus secondairement de la progression des pays de l'hémisphère Sud (Argentine, Chili, Afrique du Sud, Nouvelle Zélande et Australie). Cependant les quantités produites dans l'hémisphère Nord représentent encore 90% de la production mondiale. 1.1 La production de pommes en France et en Europe La France a produit 1,8 millions de tonnes de pommes de table sur une superficie de 49730 ha en 2003. Ces valeurs ont tendance à diminuer ces dernières années (Agreste 2004). La France est le premier exportateur mondial de pomme suivi des Etats-Unis et de l’Italie, le premier pays importateur étant l'Allemagne suivie du Royaume-Uni et de la Russie (Trillotet al. 2002). En France, le bassin Rhône Méditerranée (Languedoc Roussillon, Provence Alpes Côte d’Azur, Auvergne, Rhône-Alpes) est le premier bassin producteur avec 800 000 tonnes suivi du Bassin Val de Loire (Pays de la Loire, Centre, Poitou Charente) avec 600 000 tonneset le bassin Grand sud-ouest (Aquitaine, Midi-Pyrénées, Limousin) avec 500 000 tonnes. L’Union Européenne produit à elle seule 9 millions de tonnes de pommes. L’Italie et la France sont les premiers producteurs. La pomme est également cultivée dans les pays d’Europe de l’Est : Pologne, Hongrie et Russie. 1.2 La prise d’intérêt de la Chine pour la pomiculture La Chine est devenue le premier producteur de pommes avec 48% de la production mondiale. Les ventes de pommes de la Chine à l'étranger ont été multipliées par 7 entre 1992 et 2002. En l'espace de quelques années, les Chinois ont amélioré la qualité de leur pommes et sont ainsi devenus les deuxièmes exportateurs mondiaux en volume et les cinquièmes en valeur. Ils sont également, depuis 2000, année où ils ont détrôné la Pologne, les premiers exportateurs de concentré de jus de pommes. La production des fruits en Chine suit une courbe de progression qui pourrait rapidement en faire des concurrents pour les agriculteurs français (Masse-Stamberger 2004). La Chine est, avec le Vietnam, le pays du monde dont la production agricole a le plus augmenté au cours des dernières années selon la Food and Agriculture Organization (FAO) des Nations unies.
2 Classification botanique du pommier Le pommier appartient à la famille des Rosacées, à la sous-famille des Pomoideae et au genre Malus (pommier). Le genreMalus sous- 25 à 30 espèces selon les botanistes et plusieurs comprend espèces. Des études paléontologiques ont révélé la présence du genreMalus à l’ère tertiaire. Depuis plus d'un demi-siècle, de nombreux travaux d’hybridation ont été effectués à partir deMalus floribundaSieb.,Malus micromalus Mak.,Malus prunifolia Borkh.,Malus astrsanguinea Scnied. et d'autres espèces afin d’introduire des résistances aux maladies chez le pommier. Ceci a conduit certains chercheurs à dénommer le pommier cultivéMalusxdomesticaBorkh (Trillotet al.2002). Les variétés de pommier appartiennent à deux groupes chromosomiques. Les variétés diploïdes (2n = 34 chromosomes) : leur pollen et leurs ovules sont normalement constitués. Elles présentent une méiose régulière et un pouvoir germinatif du pollen élevé (90 à 95%). Les variétés triploïdes (3n = 51 chromosomes) : chez celles-ci, la constitution du pollen et des ovules est déséquilibrée. La méiose est irrégulière et le pouvoir germinatif du pollen est très faible (5 à 10%). Ces variétés ont tendance à donner des fruits ayant peu de pépins et qui chutent facilement. Dans cette catégorie, nous pouvons citer Belle de Booskoop et Reinette du Canada. 3 Stades phénologiques du pommier Les stades phénologiques C et C3 apparaissent à partir de début mars avec des variations selon les régions et selon les variétés. Ils marquent le début de la phase de risque d'attaque du pommier par la tavelure du pommier. Les jeunes pousses sont beaucoup plus sensibles aux maladies, donc il est nécessaire de bien protéger les premières feuilles surtout celles entourant l’inflorescence afin de limiter les risques d'infection sur fruits. Les stades G, H, I, et J sont compris dans la période du 15-20 avril au 15-20 mai. Les stades G et H représentent une phase de grande sensibilité avec la sortie de nombreux rameaux, un climat souvent pluvieux et pas très froid, propice au développement de la tavelure. La protection chimique continue est souvent difficile à cette époque à cause des pluies et nécessite l'emploi de traitements en curatif. Les trous dans le calendrier de traitements impliquent souvent l'apparition de la maladie. La phase de risque d'attaque s'arrête à la chute des feuilles. 4 Génomique du pommier Le génome du pommier n'est pas séquencé dans son ensemble. Cependant certains gènes conférant une résistance aux maladies cryptogamiques ont été isolés. Quand un caractère est dû à l'effet d'un gène principal, on parle de gène majeur. Les gènes majeurs de résistance du pommier à la tavelure sont Vf, Vr, Vm, Va et Vg. La résistance attribuée par ces gènes est de type qualitative : soit la variété de pommier sera résistante à la tavelure soit elle sera sensible. Il existe aussi des gènes de résistances partielles qui confèrent une résistance quantitative. Dans ce cas, plusieurs secteurs chromosomiques, portant un ou plusieurs gènes existant sous différentes formes allèliques, sont impliqués dans le contrôle de caractères quantitatifs. Ces locus sont appelésQTL : Quantitative Trait
Loci (Locus de Caractères Quantitatifs). Chez le pommier, les facteurs de résistance aux maladies sont distribués dans la plupart des 17 paires de chromosomes. Cependant, il y a peu de colocalisation entre les facteurs de résistance à différentes maladies. En revanche, pour une même maladie les QTL et les gènes majeurs sont co-localisés sur le génome. Les QTL de résistance à différentes souches de tavelure se concentrent dans 4 régions génomiques majeures (Durel 2003). II Les maladies cryptogamiques du pommier 1 La tavelure du pommier La tavelure du pommier, dont l'agent pathogène est le champignonVenturia inaequalis(Cook) Wint, n'est pas une maladie récente : elle fut observée pour la première fois en Suède au début du XIXe siècle et signalée en France dès 1829. La tavelure affecte principalement les feuilles et les fruits en produisant des taches brunes, rendant les fruits invendables. 1.1 Systématique La tavelure du pommier sous sa forme sexuée (Venturia inaequalis) appartient à la division des Eumycètes, la subdivision des Ascomycètes, la classe des Loculoascomycètes, l'ordre des Pleosporales, la famille des Venturiaceae. Le nom de la forme conidienne de cet agent phytopathogène estSpilocaea pomi. Il existe une autre espèce de Venturiaceae infectant les rosacées : Venturia pirinaqui infecte le poirier. On appelle race d'agent pathogène un ensemble de souches d'un agent pathogène qui ont une virulence similaire vis-à-vis d'une gamme variétale. PourVenturia inaequalison recense actuellement sept races. 1.2 Génomique Venturia inaequalis sont principalement les gènes n’est pas séquencé dans son intégralité. Ce codant pour les protéines cibles des fongicides qui ont été séquencés. C’est le cas du gène codant pour le cytochrome b deVenturia inaequalisqui est complètement séquencé et présent dans GenBank sous la référence AF004559 (Zheng & Köller 1997). Ce gène a une taille de 12311 paires de bases (pb) et présente des introns en moyenne dix fois plus grands que les exons. Le gène codant le cytochrome b chez les autres champignons phytopathogènes, tel queBlumeria graminis, portant la même mutation est d’environ 1000 pb et sans introns. Cette taille s’approche de celle de la séquence codante du gène du cytochrome b (ARN) deVenturia inaequalisqui fait 1266 pb (AF047029). 1.3 Description des symptômes de la maladie Dès leur apparition au printemps, les feuilles sont maculées de taches arrondies, légèrement décolorées, vert olivâtre, qui deviennent rapidement brun olivâtre et souvent se rejoignent. Elles
sont nombreuses, surtout à la face supérieure. Les parties atteintes peuvent se dessécher. Les fruits présentent des taches brun olivâtre qui provoquent un arrêt de croissance de l'épiderme qui peut se crevasser. Ils peuvent aussi être déformés et ne plus grossir,devenant non commercialisables. 1.4 Cycle biologique deVenturia inaequalis Venturia inaequalis, agent de la tavelure du pommier, est un champignon biotrophe obligatoire spécifique du pommier, ayant une partie de son cycle saprophytique. C’est un champignon ascomycète hétérothallique combinant une phase de reproduction sexuée obligatoire chaque année et plusieurs cycles de reproduction végétative lors de la phase parasitaire. Le champignon se conserve en hiver sous forme de périthèces dans les feuilles. Le périthèce est l’organe de fructification issu de la phase sexuée du champignon et il renferme les asques qui contiennent chacun 8 ascospores. Au printemps, les périthèces mûrissent et les ascospores sont alors disséminées dans des éclaboussures de pluies sur les organes verts de l'arbre. La maturité des ascospores coïncide pratiquement avec le débourrement des pommiers ce qui constitue un stade de haut risque de contamination primaire. Les premiers coussinets conidifères (taches vert olivâtre) apparaissent 20 jours plus tard constituant les premiers foyers disponibles pour de nouvelles contaminations de la phase asexuée (contamination secondaire) (Jones and Aldwinckle 1990). 1.5 Epidémiologie La pluie est nécessaire à la libération des ascospores qui, entraînées par le vent et le ruissellement, sont ensuite disséminées. Les ascospores ne germent qu’en présence d’eau liquide et à des températures comprises entre 1 et 32°C (T°C optimale : 17 à 23°C). Les risques de contamination selon la température et la durée d’humectation sont établis au niveau des courbes de Mills. La spore émet alors un tube germinatif qui se renfle au contact de la cuticule. Cette partie gonflée et aplatie du filament fongique qui adhère à la surface de la plante supérieure s’appelle un appressorium et fournit l'ancrage pour l'invasion par un mycète. La cuticule est transpercée mécaniquement par un hyphe de pénétration, puis un mycélium sous-cuticulaire se développe. Les taches primaires de tavelure apparaissent après une période d’incubation de 18 à 25 jours suivant les conditions météorologiques du printemps. A la fin de cette période d’incubation, le mycélium crève la cuticule et émet des conidies à l’extrémité de supports très courts appelés conidiophores. La pluie détache les conidies qui, entraînées par l’eau de ruissellement, peuvent réaliser des contaminations secondaires qui se succèdent au gré des pluies en redonnant des fructifications conidiennes. 1.6 Relation hôte-parasite Les conidies deVenturia inaequalisdes variétés sensibles et résistantes depeuvent germer sur pommier, donner un filament germinatif et former un ou plusieurs appressoria. Le nombre de conidies germées et d’appressoria est significativement plus faible dans le cas d'une relation avec un hôte
différent du pommier (relation non hôte). Les observations à 6 jours montrentque lors de l'infection de l'hôte spécifique, il se forme un réseau subcuticulaire dense sur les hôtes sensibles. Les hôtes résistants sont caractérisés par un stroma (agglomération d'hyphes mycéliennes) primaire très réduit. Dans le cas de la relation non hôte, il se forme très rarement un stroma primaire. 2 Les autres maladies cryptogamiques du pommier 2.1 L'oïdium du pommier Le développement de cette maladie dont l'agent pathogène estPodosphaera leucotricha dépend principalement de la sensibilité variétale. Généralement la protection chimique n'est pas spécifique à cette maladie mais elle est couplée à la lutte anti-tavelure du pommier. Les symptômes de la maladie en hiver se caractérisent par des rameaux grêles et rabougris avec un feutrage gris blanchâtre. Au printemps, les pousses oïdiées de l'année précédente produisent des inflorescences atrophiées avec des symptômes identiques. Les feuilles sont sujettes aux contaminations secondaires avec l'apparition d'un feutrage blanc. Les fruits sont parfois atteints et montrent une altération de la coloration. La conservation hivernale se fait sous forme mycélienne dans les écailles des bourgeons. Au printemps, à partir du stade phénologique C, le mycélium reprend son activité et il envahit les jeunes pousses ainsi que les inflorescences. 2.2 Le chancre à Nectria Différents chancres peuvent atteindre le pommier : le chancre à Nectria, le chancre à Diaporthe ou encore le chancre à Sphaeropsis. Le chancre à Nectria,Nectria galligena, est le plus important, les autres sont peu fréquents sur pommier. Des taches brun chocolat apparaissent sur des lésions des bois de l'arbre. Elles évoluent vers un chancre pouvant provoquer un flétrissement brusque. Les symptômes sur fruits en verger apparaissent sous forme de pourriture sèche au niveau de l'œil ou du pédoncule alors que sur fruit en conservation il s'agit de pourriture circulaire à contour net, lenticellaire. Le champignon se conserve durant l'hiver sous forme de périthèces dans les chancres âgés de 3-4 ans et sous forme conidienne dans les jeunes chancres. 2.3 Les monilioses Sur les espèces à pépins comme le pommier,Monilia fructigena infecte surtout les fruits. Monilia laxa, capable d'attaquer les fleurs et les rameaux est beaucoup moins fréquent.Monilia fructicola basse vallée duprésent sur arbre à noyau dans le sud-est de la France (moyenne et est Rhône) mais il n'a pas encore été observé dans des vergers de pommiers.
