DÉVELOPPEMENT DE MÉTHODES MOLÉCULAIRES POUR L'IDENTIFICATION ET LE DÉNOMBREMENT DE SOUCHES DE VIBRIO CHOLERAE ET DE VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS DANS L'ENVIRONNEMENT HYDRIQUE ET LES PRODUITS DE LA MER
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Niveau: Supérieur
MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre DIPLÔME POST-DOCTORAL Présenté par : ANNICK ROBERT-PILLOT DÉVELOPPEMENT DE MÉTHODES MOLÉCULAIRES POUR L'IDENTIFICATION ET LE DÉNOMBREMENT DE SOUCHES DE VIBRIO CHOLERAE ET DE VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS DANS L'ENVIRONNEMENT HYDRIQUE ET LES PRODUITS DE LA MER Soutenu le 19 décembre 2006 devant le jury composé de : Madame Susan Saint-Just : Présidente Monsieur Philippe Hartemann : Rapporteur Monsieur Pierre Malle : Rapporteur Madame Laurence Mathieu : Examinatrice Monsieur Jean-Michel Fournier : Examinateur Diplôme préparé dans l'Unité du Choléra et des Vibrions de l'Institut Pasteur sous la direction de Monsieur le Docteur Jean-Michel Fournier EPHE Banque de Monographies SVT 1
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- exposé
MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre DIPLÔME POST-DOCTORAL Présenté par : ANNICK ROBERT-PILLOT DÉVELOPPEMENT DE MÉTHODES MOLÉCULAIRES POUR L'IDENTIFICATION ET LE DÉNOMBREMENT DE SOUCHES DE VIBRIO CHOLERAE ET DE VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS DANS L'ENVIRONNEMENT HYDRIQUE ET LES PRODUITS DE LA MER Soutenu le 19 décembre 2006 devant le jury composé de : Madame Susan Saint-Just : Présidente Monsieur Philippe Hartemann : Rapporteur Monsieur Pierre Malle : Rapporteur Madame Laurence Mathieu : Examinatrice Monsieur Jean-Michel Fournier : Examinateur Diplôme préparé dans l'Unité du Choléra et des Vibrions de l'Institut Pasteur sous la direction de Monsieur le Docteur Jean-Michel Fournier EPHE Banque de Monographies SVT 1
- bactéries dans les eaux côtières
- développement economique
- vibrio parahaemolyticus
- amélioration des méthodes de dénombrement …………………………………
- souche
- méthode d'analyse
- amélioration de la qualité et de l'innocuité des aliments
MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L’EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre DIPLÔME POST-DOCTORAL Présenté par : ANNICK ROBERT-PILLOT DÉVELOPPEMENT DE MÉTHODES MOLÉCULAIRES POUR L’IDENTIFICATION ET LE DÉNOMBREMENT DE SOUCHES DE VIBRIO CHOLERAE ET DE VIBRIO PARAHAEMOLYTICUS DANS L’ENVIRONNEMENT HYDRIQUE ET LES PRODUITS DE LA MER
Soutenu le 19 décembre 2006 devant le jury composé de : Madame Susan Saint-Just : Présidente Monsieur Philippe Hartemann : Rapporteur Monsieur Pierre Malle : Rapporteur Madame Laurence Mathieu : Examinatrice Monsieur Jean-Michel Fournier : Examinateur Diplôme préparé dans l’Unité du Choléra et des Vibrions de l’Institut Pasteur sous la direction de Monsieur le Docteur Jean-Michel Fournier
RESUME
ABSTRACT
Deux principales espèces de vibrions sont pathogènes pour l’homme, Vibrio cholerae et Vibrio parahaemolyticus . La prévention des infections humaines à vibrions, consécutives à un contact avec les eaux côtières et saumâtres ou à la consommation de produits de la mer, est associée à l’amélioration des méthodes d’identification des dangers. La détection des souches de V. parahaemolyticus par amplification de la séquence R72H spécifique de l’espèce a été validée et la recherche des gènes tdh et trh codant pour des hémolysines a permis d’identifier, au sein de cette espèce, les isolats pathogènes pour l’homme. En France, les souches d’origine environnementale portent principalement le gène trh et leur répartition varie en fonction des régions. Les souches d’origine humaine possèdent pour la plupart les gènes hémolytiques tdh et/ou trh , et la présence du nouveau clone pandémique O3:K6 a été démontrée dans l’environnement côtier français. En outre, afin d’évaluer quantitativement le risque, deux méthodes de dénombrement ont été développées : d’une part, la méthode moléculaire d’hybridation sur colonies bactériennes pour la recherche des souches de V. cholerae dans l’eau de l’estuaire de la Rance par la détection d’une séquence de l’espace intergénique 16S-23S, spécifique de l’espèce, et d’autre part, la méthode de PCR quantitative en temps réel pour détecter et quantifier directement dans des échantillons environnementaux contaminés artificiellement, les deux espèces d’importance médicale, V. cholerae et V. parahaemolyticus . Mots clés : Vibrio cholerae , Vibrio parahaemolyticus , Clone pandémique O3:K6, Gènes tdh et trh , Eau, Coquillages, Côtes françaises, Hybridation sur colonies, PCR en temps réel Two species are especially recognized as human pathogens, Vibrio cholerae et Vibrio parahaemolyticus . To prevent human Vibrio infections, occurred either by direct contact with brakish or sea water or following the consumption of seafood, we have to dispose of efficient molecular methods for the detection and identification of the pathogenic vibrio strains. A PCR method, based on the R72H V. parahaemolyticus -specific sequence, was developped to identify V. parahaemolyticus. Only isolates that produce one or both of the two hemolysins - TDH and TRH - are pathogenic. Thus, we have developed a PCR method to detect the genes encoding these hemolysins. Few isolates from environmental samples carried the hemolysin genes, the occurrence depending on the geographic site. In contrast, most of the clinical isolates possessed the hemolysin genes and we report the first evidence for the presence of the newly pathogenic V. parahaemolyticus strains belonging to the new O3:K6 pandemic clone in France. Efforts have also focused on the quantification of the risk. We have developped a method based on colony hybridization assay for the detection of Vibrio cholerae in the Rance estuary water samples, by using the nucleotide sequence of the 16S-23S rDNA intergenic spacer region as a probe, and a real-time PCR method to detect and quantify directly in artificially contaminated environmental samples two medically important Vibrio species, V. cholerae and V. parahaemolyticus. Keywords : Vibrio cholerae , Vibrio parahaemolyticus , pandemic O3:K6 clone, tdh and trh genes, water, Shellfish, French coastal areas, Colony hybridization assay, Real-time PCR
SOMMAIRE
