Caractérisation des protéasomes chez Leishmania major
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2007
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Niveau: Supérieur
MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES SCIENCE DE LA VIE ET DE LA TERRE MEMOIRE présenté par Sabrina MEGHAMLA Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes Caractérisation des protéasomes chez Leishmania major Soutenance le 19 janvier 2007 Laboratoire EPHE: Directeur: Pr. Yves BENYAMIN Motilité cellulaire, UMR 5539 Université Montpellier II Place Eugène Bataillon 34095 Montpellier Cedex 5 Laboratopire d'accueil: Directeur: Pr Jean-Pierre DEDET Biologie Moléculaire et Tuteur: Michel Pagès Génome des Protozoaires Parasites » CNRS-UMR 5093 163, Rue A.Broussonnet 34090 Montpellier EPHE Banque de Monographies SVT 1
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MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES SCIENCE DE LA VIE ET DE LA TERRE MEMOIRE présenté par Sabrina MEGHAMLA Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes Caractérisation des protéasomes chez Leishmania major Soutenance le 19 janvier 2007 Laboratoire EPHE: Directeur: Pr. Yves BENYAMIN Motilité cellulaire, UMR 5539 Université Montpellier II Place Eugène Bataillon 34095 Montpellier Cedex 5 Laboratopire d'accueil: Directeur: Pr Jean-Pierre DEDET Biologie Moléculaire et Tuteur: Michel Pagès Génome des Protozoaires Parasites » CNRS-UMR 5093 163, Rue A.Broussonnet 34090 Montpellier EPHE Banque de Monographies SVT 1
- ubiquitinylation des protéines
- arn interférence ciblant les protéines hslv
- identification des gènes correspondants dans les banques de données
- pb paire de base pcr
- organisation mondiale de la santé
- désoxyribonucléique arn
- protéasome
MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L’EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES SCIENCE DE LA VIE ET DE LA TERRE MEMOIRE présenté par Sabrina MEGHAMLA Pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes Caractérisation des protéasomes chez Leishmania major Soutenance le 19janvier 2007 Laboratoire EPHE: Directeur: Pr. Yves BENYAMIN Motilité cellulaire, UMR 5539 Université Montpellier II Place Eugène Bataillon 34095 Montpellier Cedex 5 Laboratopire d'accueil: Directeur: Pr Jean-Pierre DEDET "Biologie Moléculaire et Tuteur: Michel Pagès Génome des Protozoaires Parasites »" genpara@univ-montp1.fr CNRS-UMR 5093 163, Rue A.Broussonnet 34090 Montpellier
Résumé Leishmania majorest un protozoaire parasite flagellé de la famille des Trypanosomatidés, responsable des leishmanioses. En dehors de son importance en santé publique, cet eucaryote dit "primitif" présente un grand intérêt en tant que modèle en biologie cellulaire et moléculaire, du fait d'un grand nombre d'originalités. Parmi celles-ci, il existe un consensus actuel pour dire que le niveau de régulation de la transcription est très faible (voire nul). Ainsi, aucun promoteur de l'ARN-polymérase II n'a pu être à ce jour mis en évidence, à la seule exception du gène du mini-exon intervenant dans le trans-épissage. La régulation de l'expression des gènes semble donc essentiellement post-transcriptionnelle, traductionnelle et post-traductionnelle. Pour cette dernière étape, le protéasome 26S, conservé chez les eucaryotes, joue probablement un rôle clé chez ces organismes. En outre, en explorant une banque de cDNA, la présence d'un protéasome de type procaryote (HslVU) avait été signalée chezLeishmaniapar Couvreuret al. HslVU y co-existe donc avec le protéasome eucaryote classique. Le travail présenté ici a consisté à mieux caractériser ces complexes chez ce parasite. Après l’identification des gènes correspondants dans les banques de données, 8 protéines ont été recombinées en les fusionnant avec la GFP ou d'autres tags (c-Myc ou HIS6x). Leur localisation a ainsi pu être déterminée en microscopie à fluorescence. Ces travaux ont montré que, si le protéasome 26S semble principalement être localisé dans le cytoplasme et plus particulièrement dans la région péri-nucléaire, le protéasome HslVU est strictement localisé au niveau de la mitochondrie. Ceci se révèle particulièrement intéressant de point de vue évolutif. Pour compléter ce travail, une approche d'ARN interférence ciblant les protéines HslV, HslU1 et HslU2 a été développée. Ceci a montré que ce complexe HslVU est nécessaire à la multiplication du parasite. Le protéasome procaryote pourrait ainsi constituer une cible thérapeutique hautement spécifique pour cette classe de pathogènes eucaryotes. Mots clés :Leishmania, protéasome 26S, complexe HslVU, ARN interférence, mitochondrie.
TABLE DES MATIERES
ABRÉVIATIONS 4
INTRODUCTION 6
PARTIE 1 : LE PARASITE 6 1. Les Trypanosomatidés 6 1.1 Leishmania 6 1.2 Trypanosoma brucei 8 1.3 Les vecteurs 8
1.4 Le cycle parasitaire
9 1.5 Le cycle cellulaire 10 2. Particularités morphologiques, génomiques et biologiques deLeishmania 12 2.1 La morphologie du parasite 12 2.2 Le génome kinétoplastique 12 2.3 Le génome nucléaire 13 2.4 Organisation du génome : exemple du chromosome 1. 14
PARTIE 2 : LE PROTÉASOME 17 1. Le protéasome des eucaryotes 17 1.1 La structure du protéasome 20S 17 1.2 L’activité du protéasome 20S 18 1.3 Les co-facteurs 19S et 11S 19 1.4 Le protéasome 26S. 21 1.5 L’ubiquitinylation des protéines. 22 2. Le protéasome des protozoaires parasites 22 3. Le complexe HslVU 23 3.1 Présentation des protéases des procaryotes 23 3.2 Le complexe HslVU chezE. coli 24 3.3 L’homologue d’HslVU chez les Trypanosomatidés 25
Abréviations ADN Acide DésoxyriboNucléique ARN Acide RiboNucléique ARNm Acide RiboNucléique messager ATP Adénosine TriPhosphate BLAST Basic Local Alignment Search Tool BSA Bovine Serum Albumine Ch Chromosome Clp Caseinolytic protease C-ter C-terminal DAPI Di Aminido Phenyl Indol DHFRTS DiHydroFolate Réductase-Thymidilate Synthétase DO: Densité Optique DMSO DiMéthyl SulfOxide EPHE Ecole Pratique des Hautes Etudes
FRET Fluorescence Resonance Energy Transfert GFP Green Fluorescent Protein Hsl Heat shock locus IPTG IsoPropyl b-D-ThioGalactopyranoside kb kilobase kDa kiloDaltons LB Luria Bertani Mb MegaBase MCAK Mitotic Centromere Associated Kinesin Mda MégaDaltons NCBI National Center for Biotechnology Information N-ter N-terminal OMS Organisation Mondiale de la Santé PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis pb paire de base PCR Polymerase Chain Reaction PFA ParaFormAldéhyde RISC RNA-Induced Silencing Complex RPMI Roswell Park Memorial Institute Medium RT-PCR Reverse Transcriptase- Polymerase Chain Reaction SDM Semi Defined Medium SDS Sodium Dodécyl Sulfate SGD Saccharomyces Genome Database SluA SVF Sérum de Veau Fœtal Ta Annealing Temperature = température d'hybridation TBE Tris Borate EDTA U Unité UMR Unité Mixte de Recherche UTR UnTranslated Region VIH Virus de l’Immuno-déficience Humaine VSG Variant Surface Glycoprotein v/v volume à volume X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactopyranoside YFP Yellow Fluorescent Protein
Introduction
Partie 1 : Le parasite Les Trypanosomatidés regroupent trois principaux protozoaires parasites pathogènes pour l'homme :Leishmania, responsable de la leishmaniose,Trypanosoma brucei etTrypanosoma cruzi agents respectifs de la maladie du sommeil et de Chagas chez l’homme. Au cours de mon travail centré surLeishmania, nous avons également développé certaines approches surT. brucei, les expériences d'ARN interférence étant seulement possibles sur ce modèle. Nous présentons successivement dans cette introduction les principales caractéristiques de ces deux parasites. 1. Les Trypanosomatidés Leishmania majoretTrypanosoma bruceisont des protozoaires parasites flagellés de l’ordre des Kinetoplastidaet de la famille des Trypanosomatidés. 1.1 Leishmania Parmi les 30 espèces deLeishmania, 13 sont pathogènes pour l’homme et provoquent des parasitoses appelées leishmanioses, pouvant être plus ou moins sévères. Ces parasitoses sont considérées comme l’une des six maladies prioritaires du programme Tropical Diseases Research (TDR) par l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS). Celle-ci a recensé 12 millions de personnes atteintes par les leishmanioses et 1,5 millions de nouveaux cas chaque année (Desjeux, 1999). Ainsi, la population à risque est estimée à 350 millions dans les foyers endémiques. Les zones à risque sont très nombreuses et largement étendues dans le monde : 88 pays dispersés sur les quatre continents, seule l’Australie étant épargnée. Elles couvrent la zone intertropicale, avec une forte extension dans les régions tempérées, de l’Afrique du Nord-Est au Sud de l’Europe, en passant par le pourtour méditerranéen et l’Asie centrale, dont la Chine et l’Inde (Desjeux, 1999), ainsi que l’Amérique latine.
Les critères morphologiques seuls ne permettent pas de différencier les espèces deLeishmania. Leur identification nécessite l’utilisation de critères intrinsèques (phénotype et génotype) et extrinsèques (forme clinique, distribution géographique, nature de l’hôte). Selon l’espèce,Leishmania est responsable d’affections anthropozoonotiques différentes. Les leishmanioses sont caractérisées par un grand polymorphisme d'expression clinique. Ainsi, on distingue les formes cliniques suivantes : - Les leishmanioses tégumentaires, caractérisées par des lésions cutanées localisées ou diffuses et cutanéo-muqueuses. On distingue les leishmanioses cutanées du Nouveau Monde et celles de l'Ancien Monde. Les leishmanioses cutanées du Nouveau Monde sont dues aux espècesL. guyanensis,L. mexicana à leurs sous-espèces. etDans l'Ancien Monde, les leishmanioses cutanées localisées sont principalement dues àL. major,L. tropica,L. aethiopica ;elles provoquent des ulcérations dermiques laissant des cicatrices permanentes. Elles guérissent spontanément, contrairement aux leishmanioses cutanées diffuses. Néanmoins, ces dernières restent rares. Elles sont souvent liées à une déficience de la réponse immunitaire de l’hôte, le parasite se retrouvant dans les ganglions lymphatiques et diffusant dans d’autres sites cutanés. Dans leNouveau Monde, les leishmanioses cutanéo-muqueuses répandues en Amérique Tropicale, dues àL. brasiliensiset àL. panamensis, provoquent des lésions pouvant être fortement mutilantes au niveau des muqueuses faciales (le nez, la bouche et la gorge). es leishmanioses viscérales (LV): maladies chroniques et mortelles. En Inde, ces - L leishmanioses, connues sous le nom de Kala-Azar, sont responsables d’une forte mortalité infantile. Elles sont caractérisées par de fortes fièvres, une splénomégalie, un amaigrissement et une anémie très souvent suivie d’une immunodépression qui entraîne la mort. Elles sont dues àL. infantumetL. donovani SIDA. Cette parasitose est devenue plus préoccupante depuis l’apparition du (Syndrome d’Immuno-Déficience Acquise). La conjugaison des deux infections provoque une double immuno-déficience. En effet, les leishmanies et le VIH (Virus de l’Immuno-déficience Humaine) détruisent les mêmes cellules, augmentant ainsi de façon exponentielle la gravité et les conséquences de la maladie. De La Loma et coll (De La Loma A., 1985) furent les premiers à avoir observé la co-infection Leishmania 1994). L’OMS a (Alvar,/VIH. Et depuis, le nombre de cas ne cesse d’augmenter répertorié 1616 cas en 1998 dont 700 dans les pays du sud de l’Europe, et notamment en Espagne (Desjeux, 1996).
Les traitements des leishmanioses concernent surtout les formes viscérales et cutanéo-muqueuses. Ils sont actuellement basés sur l’utilisation de drogues anciennes : sels pentavalents d’antimoines, amphotéricine B, miltéfosine et pentamidine. Toutefois, la toxicité des produits, l’apparition de résistances et le coût élevé des médicaments rendent le traitement difficile. 1.2 Trypanosoma brucei T. bruceimaladie du sommeil chez l’homme et de la Nagana chez le responsable de la est bétail. Aujourd’hui, le parasite menace 60 millions de personnes dans 36 pays d’Afrique sub-saharienne ; environ 500000 ont déjà été contaminées et 70000 en sont mortes. Les animaux ne sont pas non plus épargnés : parmi le bétail, 3 millions périssent chaque année et 50 millions sont en danger (www.fao.orgun véritable fléau non seulement pour la santé mais également). Le parasite est pour l’économie du pays. En effet, les ravages du parasite ralentissent considérablement le développement de certaines régions africaines, accentuant ainsi leur pauvreté. T. brucei gambienseest responsable de la forme chronique de la maladie du sommeil. Il est localisé à l’ouest et au centre de l’Afrique. La forme aiguë de cette maladie est due àT. brucei rhodesience, qui sévit à l’Est et au Sud de l’Afrique.T. brucei brucei il n’infecte bétail,est l’agent pathogène chez le en aucun cas l’homme. Comme pour les leishmanioses, les médicaments (pendamidine, suramine, mélarsoprol, eflornithine, nifurtimox) utilisés contre la maladie du sommeil sont très toxiques pour les patients. De plus, les traitements peuvent devenir inutiles face aux mécanismes de résistance que le parasite peut développer. 1.3 Les vecteurs Le vecteur des leishmanioses est un insecte, le phlébotome, du genrePhlebotomusdans l’Ancien Monde etLutzomyiadans le Nouveau Monde. Il appartient à l’ordre desDiptera et à la famille des Psychodidae. Les leishmanies sont transmises par la femelle hématophage, telmophage du phlébotome lors de son repas sanguin nécessaire au développement des ovocytes. Il semblerait que l’attraction de la femelle vers l’homme dépende de sa production en CO2et de l’odeur qu’il dégage. Le mâle ne joue aucun rôle dans la propagation des leishmanioses, néanmoins on le retrouve près de l’hôte attiré par la femelle pour la reproduction. Sur les 800 espèces de phlébotomes qui existent, seulement 40 sont vecteurs de.eLishmania La mouche Tsé-Tsé, diptère du genreGlossinaest le vecteur deT. brucei. C'est l’unique genre de la famille desGlossinidae. 1.4 Le cycle parasitaire
Le cycle parasitaire deLeishmania de etT. brucei comprend deux étapes correspondant à la présence du parasite dans le vecteur phlébotome et dans l’hôte mammifère. 1.4.1
deLeishmania Les leishmanies sont des parasites dimorphiques. Elles présentent successivement deux stades morphologiques distincts: le stade amastigote, intracellulaire, retrouvé chez l’homme et le stade promastigote, extracellulaire, chez le phlébotome. La femelle phlébotome s’infecte en prenant un repas sanguin. Les amastigotes prélevés entament une phase de différenciation en promastigotes au niveau de l’intestin moyen de l’insecte. Puis, ils se divisent activement mais restent non-infectieux. Ensuite, ils s’allongent en prenant une forme fuselée atteignant une longueur de 15µm à 20µm sur 2µm de large. Cette forme mobile présente dans sa partie antérieure un flagelle qui va permettre, entre autres, la fixation du parasite entre les microvillosités des cellules épithéliales de l’intestin de l’insecte. Les promastigotes se détachent ensuite de la paroi intestinale pour migrer vers les parties antérieures du tube digestif où ils subissent alors la métacyclogenèse, phase pendant laquelle ils ne se divisent plus, deviennent plus petits, extrêmement mobiles et donnent des promastigotes métacycliques virulents. Lors d'un nouveau repas sanguin, le phlébotome femelle inocule lors de la régurgitation de salive, les promastigotes métacycliques virulents dans le derme de l’hôte mammifère. Les parasites sont neutralisés par les globules blancs et les leucocytes et certains s’introduisent dans les macrophages grâce à des récepteurs spécifiques. Le parasite détourne ces cellules comme cellules hôtes, et se différencie en amastigote : cellule arrondie ou ovale (2 à 6 µm de diamètre) ayant un flagelle interne la rendant immobile. Le parasite se multiplie par fission binaire au sein d’une vacuole parasitophore dans le macrophage, qui finit par être lysé. Les amastigotes ainsi libérés, envahissent les cellules avoisinantes du système phagocytaire mononucléé, ce qui permet au parasite de disséminer dans l’organisme. Le stade de développement du parasite peut être suivi par l’étude de la morphologie du parasite ou par l’identification des protéines de surface. En effet, les promastigotes sont recouverts d’un manteau protéique dont les protéines possèdent un ancrage GPI (GlycosylPhosphatidylInositol), contrairement aux amastigotes presque dépourvus de ces protéines (Pimenta et al., 1991). Parmi celles-ci, le LPG (LipoPhosphoGlycane), retrouvé en grande quantité à la surface des promastigotes, joue un rôle important dans l’infection du vecteur et dans l’interaction avec les macrophages de l’hôte mammifère (Spath et al., 2003). Une autre protéine tout aussi importante est la gp63, protéine glycosylée à activité métalloprotéase. Elle participe, entre autres, à la protection deLeishmaniacontre la lyse cellulaire. 1.4.2
deT. brucei C’est lors de son repas sanguin que la mouche Tsé-Tsé s’infecte en ingérant des
trypomastigotes sanguins. Les parasites se retrouvent alors dans l’intestin de la mouche et s’y multiplient par fission binaire. Les trypomastigotes procycliques non virulents se transforment en épimastigotes et migrent vers les glandes salivaires puis s’y multiplient. Les épimastigotes deviennent des trypomastigotes métacycliques, formes non réplicatives mais très virulentes. 21 jours après, la mouche devient infectieuse. Lors d’un nouveau repas sanguin, la mouche Tsé-Tsé injecte des trypomastigotes métacycliques virulents à l’hôte mammifère. Dans le sang de ce dernier, les trypomastigotes s’allongent (25-30 µm de long) et s’affinent (2-3 µm large) pour donner des trypomastigotes sanguins. Après la voie sanguine, les parasites envahissent la voie lymphatique. L’homme devient porteur de la maladie et peut la transmettre à sa descendance. 1.5 Le cycle cellulaire Le cycle cellulaire des Trypanosomatidés est étroitement lié à leur cycle de vie (Matthews and Gull, 1994). ChezLeishmania, les différentes étapes de ce cycle sont mal connues. En revanche, l’étude du cycle cellulaire chezT. bruceipermis de retrouver les principales étapes communes à a l’ensemble des cellules eucaryotes. Néanmoins, il présente quelques particularités sur certains points et notamment lors de la mitose. En effet, la mitose est de type intranucléaire fermée sans condensation des chromosomes. Elle suit une chronologie bien précise mettant en jeu les 3 principaux organites de la cellule : le corps basal, le kinétoplaste et le noyau. Après la duplication du corps basal et du flagelle, le kinétoplaste entre en réplication, suivi par le noyau (Kohl et al., 2003). La division de ce dernier s’effectue sans disparition de la membrane nucléaire (Ogbadoyi et al., 2000; Solari, 1995). Les chromosomes se répartissent alors dans les noyaux fils et la cytodiérèse s'effectue selon l'axe longitudinal du parasite (McKean, 2003; Solari, 1995).
2. Particularités morphologiques, génomiques et biologiques dehmaniaLeis Bien que la maladie soit connue bien avant les Incas, la découverte du parasite ne date que du début du XXème la Les approches de biologie moléculaire ont permis de mieux comprendre siècle. structure et l’organisation de son génome. Celles-ci présentent une grande originalité dans de nombreux aspects, originalité liée à la grande distance phylogénétique entre ce parasite et les êtres vivants classiquement étudiés tels que l'homme et la levure, (Baldauf, 2003b) . Parmi ces aspects, la présence de deux génomes, l’un nucléaire et l’autre kinétoplastique peut être notée. 2.1 La morphologie du parasite La cellule procyclique deL. major cellule les organelles structuraux existant dans une contient eucaryote : le noyau, le réticulum endoplasmique, l’appareil de golgi, et une mitochondrie unique.
2.2 Le génome kinétoplastique Le kinétoplaste est un organite unique, localisé à la base du flagelle, et considéré comme un ADN mitochondrial modifié (Vickerman, 1976). En effet, c’est une portion particulière de l’unique mitochondrie. Le kinétoplaste représente, selon le genre, de 10 à 20 % de l’ADN total de la cellule. Il est constitué de deux types de molécules d’ADN circulaire : les maxi-cercles (au nombre de 10 à 30) et les mini-cercles (de 5000 à 10000), entrelacés les uns dans les autres, constituant ainsi un réseau complexe et compact (Simpson, 1987). Les maxi-cercles, d’une taille de 20 à 40 kb suivant les espèces, sont identiques dans un même réseau. Ils sont équivalents à l’ADN mitochondrial des eucaryotes supérieurs. En effet, ils codent pour des gènes classiques de la mitochondrie tels que les gènes de l’ARN ribosomique (ARNr), les gènes de la chaîne de transport des électrons (cytochrome oxydase, complexe NADH déshydrogénase, apocytochromeb) mais également les gènes codant de petits ARN appelés ARN guides (ARNg) qui interviennent dans un processus très original de modification post transcriptionnelle de la séquence des ARN messagers appelé ARN editing. Les mini-cercles d’une taille inférieure à 1 kb, codent aussi pour des ARN guides. Mais, contrairement aux maxi-cercles, leur séquence est très variable, non seulement d’une espèce à l’autre, mais également au sein d’une même espèce, voire dans un même réseau (Stuart, 1991). 2.3 Le génome nucléaire Depuis l’essor de la biologie moléculaire dans les années 80, le génome deLeishmaniaa fait l’objet de nombreux travaux. L’une des principales caractéristiques de son génome est sa richesse en G/C : elle atteint en moyenne 60 % et peut être supérieure dans les régions codantes (Alonso et al., 1992)-(Alvarez et al., 1994). Peu complexe, le génome comporte 60 à 65 % de séquences uniques, 13 % de séquences moyennement répétées et environ 12 % de séquences fortement répétées (Leon et al., 1978). Parmi ces dernières, une vingtaine de loci microsatellites et un motif dans les séquences télomériques, identique à celui décrit chez l’homme (CCCTAA) ont été identifiés (Ellis et al., 1989). Les séquences centromériques pourraient être localisées dans ces régions subtélomériques (Dubessay et al., 2001; Dubessay et al., 2002b). Leishmania et al., 1992a)). Ce résultat a (Bastien essentiellement diploïde (synthèse dans est été déduit des expériences deknock-outsur des gènes non essentiels, pour lesquels deux séries de transfections ont été nécessaires pour supprimer l’expression génique (Cruz et al., 1991; Souza et al., 1994)-(Webb and McMaster, 1994). Paradoxalement, l’ensemble des marqueurs utilisés (iso-enzymes, microsatellites, isoformes chromosomiques) montre une forte homozygotie à la plupart des loci (synthèse dans (Bastien et al., 1992b) ; (Rossi et al., 1994); (Blaineau et al., 1992)). Par ailleurs, les travaux effectués au laboratoire d’accueil ont montré l’existence d’une trisomie pour certains chromosomes, variable suivant la souche (Dubessay et al., 2002a) et qui est bien supportée par le
parasite. Le nombre de chromosomes chezLeishmaniaest resté longtemps indéterminé, en raison de l’absence de condensation des chromosomes au cours du cycle cellulaire (Raikov, 1982) et de l'impossibilité de réaliser des études génétiques classiques chez ce parasite. Les chromosomes deLeishmania été ont visualisés grâce à la technique d’électrophorèse en champ pulsé qui a permis de déterminer le caryotype moléculaire. La caractérisation des 36 groupes de liaison physique, correspondant aux 36 chromosomes hétérologues, a nécessité 244 marqueurs de séquence unique et spécifique d’un chromosome donné (Wincker et al., 1996). Ces groupes de liaison sont fortement conservés entre espèces, même éloignées sur le plan phylogénétique. Ces résultats ont justifié le choix d’une seule souche de référence pour le programme de séquençage du génome deLeishmania. Cependant, la comparaison des caryotypes des espèces de l'Ancien Monde avec ceux des espèces pathogènes du Nouveau Monde a révélé trois remaniements chromosomiques basés sur la fusion de deux chromosomes. Ainsi,L. braziliensisne compte plus que 35 chromosomes (fusion des chromosomes 20 et 34) etL. mexicana,34 (fusion des chromosomes 20 et 36 ainsi que 8 et 29) (Britto et al., 1998). Les analyses du caryotype moléculaire par électrophorèse en champ pulsé ont ainsi permis de déterminer les caractéristiques structurales du génome deLeishmania; celui-ci fait ainsi 36 Mb avec une variation de± 0.5 et al., 1996), correspondant aux 36 Mb selon la souche (Wincker chromosomes (0.28 à 2.8 Mb). Cette petite taille est relativement constante pour toutes les espèces de l’Ancien et du Nouveau Monde (Wincker et al., 1996), (Britto et al., 1998). Aujourd’hui, le génome deLeishmania gènes codant des 8272 séquencé (Ravel, 1998). Ivens et coll décriventest entièrement protéines, 911 gènes d’ARN et 39 pseudo-gènes (Ivens et al., 2005). 2.4 Organisation du génome : exemple du chromosome 1. Le séquençage du génome entrepris sur la soucheL. major a mis en lumière une Friedlin étonnante organisation des gènes : ainsi sur le chromosome 1, les 79 gènes identifiés sont regroupés en deux unités de type polycistronique de 29 et 50 gènes mais, contrairement aux opérons bactériens, les gènes ici regroupés n’ont aucun rapport fonctionnel entre eux (Myler et al., 1999). Ces deux unités polycistroniques sont présentes chacune sur un brin et pour chacune le sens de transcription est dirigé vers les télomères (McDonagh et al., 2000). Ces deux groupes de gènes sont séparés par une courte séquence de 1,6 kb appelée « strand-switch region » ou « switch region ». Actuellement, le seul point d'initiation de la transcription identifié est localisé sur cette même région (Martinez-Calvillo et al., 2003). Le séquençage de cette région switch sur 15 espèces deLeishmaniaauquel j'ai participé, a permis de mettre en évidence une nouvelle ORF conservée dans toutes les espèces, réduisant ainsi la taille de la « switch region » à 973 pb.(Annexe 5) 3.Très forte synténie entre les génomes nucléaires deL. majoretT. brucei.
