CANCER DU SEIN PRECOCE ET MUTATIONS PUTATIVES CONSTITUTIONNELLES DES GENES BRCA1 ET BRCA2 : ETUDE DE LEURS CONSEQUENCES FONCTIONNELLES
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2004
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Niveau: Supérieur
MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Science de la Vie et de la Terre MEMOIRE Présenté par Sandrine BURLINCHON pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes CANCER DU SEIN PRECOCE ET MUTATIONS PUTATIVES CONSTITUTIONNELLES DES GENES BRCA1 ET BRCA2 : ETUDE DE LEURS CONSEQUENCES FONCTIONNELLES Soutenu le 27 octobre 2004 devant le jury suivant : András Paldi Jean-Marie Exbrayat Janet Hall Olga Sinilnikova Président Rapporteur Examinatrice Examinatrice Laboratoire d'étude de la reproduction et du développement des vertébrés Laboratoire EPHE (Sciences de la vie et de la terre) Faculté Catholique de Lyon 25 rue du Plat 69002 Lyon EPHE Banque de Monographies SVT 1
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MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Science de la Vie et de la Terre MEMOIRE Présenté par Sandrine BURLINCHON pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes CANCER DU SEIN PRECOCE ET MUTATIONS PUTATIVES CONSTITUTIONNELLES DES GENES BRCA1 ET BRCA2 : ETUDE DE LEURS CONSEQUENCES FONCTIONNELLES Soutenu le 27 octobre 2004 devant le jury suivant : András Paldi Jean-Marie Exbrayat Janet Hall Olga Sinilnikova Président Rapporteur Examinatrice Examinatrice Laboratoire d'étude de la reproduction et du développement des vertébrés Laboratoire EPHE (Sciences de la vie et de la terre) Faculté Catholique de Lyon 25 rue du Plat 69002 Lyon EPHE Banque de Monographies SVT 1
- série de tests
- tissus annexe
- spectre de mutations des gènes brca1
- brca1
- brca2
- extraction d'adn
- rneasy annexe
- mutations putatives
- examinatrice examinatrice
MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L’EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Science de la Vie et de la Terre MEMOIRE Présenté par Sandrine BURLINCHON pour l’obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes CANCER DU SEIN PRECOCE ET MUTATIONS PUTATIVES CONSTITUTIONNELLES DES GENES BRCA1ETBRCA2: ETUDE DE LEURS CONSEQUENCES FONCTIONNELLES Soutenu le 27 octobre 2004 devant le jury suivant :
András Paldi Jean-Marie Exbrayat Janet Hall Olga Sinilnikova
Président Rapporteur Examinatrice Examinatrice Laboratoire d’étude de la reproduction et du développement des vertébrés Laboratoire EPHE (Sciences de la vie et de la terre) Faculté Catholique de Lyon 25 rue du Plat 69002 Lyon
Unité d'épidémiologie génétique Centre International de Recherche sur le Cancer 150 cours Albert Thomas 69372 Lyon Cedex 08 Pr J.M EXBRAYAT jmexbrayat@univ-catholyon.fr
Dr D. GOLDGAR Dr O. SINILNIKOVA sinilnikova@iarc.fr
ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES SCIENCES DE LA VIE ET DE LA TERRE CANCER DU SEIN PRECOCE ET MUTATIONS PUTATIVES CONSTITUTIONNELLES DES GENESBRCA1ETBRCA2 :ETUDE DE LEURS CONSEQUENCES FONCTIONELLES Sandrine BURLINCHON RESUME
Dans les pays industrialisés, le cancer du sein est le cancer le plus fréquent chez la femme. Parmi l’ensemble des cas de cancers du sein, il est considéré qu’environ 10% ont une composante héréditaire associée à un risque très élevé de développer la maladie. Deux gènes majeurs de prédisposition au cancer du sein ont été mis en évidence, BRCA1 etBRCA2. Les estimations du risque des porteuses de mutations BRCA1ouBRCA2de développer un cancer du sein à l’âge de 70 ans varient de 40 à 85%. Ce projet a pour but d’estimer la contribution des anomalies des gènesBRCA1 etBRCA2 dans la survenue du cancer du sein précoce ; d’une part, celles des mutations clairement délétères et, d’autre part, celles des variants rares d'une signification biologique inconnue. L’étude porte sur deux populations de femmes atteintes de cancer du sein précoce (<46 ans) dans la région du Rhône en France et dans les régions de Gérone et de Tarragone en Espagne. Dans le cadre de ma formation à l’Ecole Pratique des Hautes Etudes, mon travail portait sur l’évaluation des conséquences biologiques de mutations putativesBRCA1 etBRCA2 grâce à une série de tests, afin d’attribuer une probabilité à chacune d’elle d’être une mutation délétère ou un polymorphisme neutre. Les effets des mutationsBRCA1 etBRCA2 sur la réparation des dommages de l’ADN ont été reportés dans plusieurs études. Une des caractéristiques de ces effets est l’augmentation de la formation de micronoyaux. J’ai donc utilisé ce phénomène afin de mettre au point le test basé sur la mesure du taux de micronoyaux formés suite à l’endommagement de l'ADN par irradiation. Ceci permet de différencier les lignées lymphoblastoïdes portant des mutations délétèresBRCA1 ouBRCA2 des lignées lymphoblastoïdes contrôle (p<0.001). Ce test, appliqué aux 14 lignées lymphoblastoïdes porteuses de mutations putatives faux-sens
BRCA1 ouBRCA2, a permis d’identifier les variants associés à un niveau de radiosensibilité similaire à celui des lignées portant des mutations délétèresBRCA1/2 radiosensibilité, les variants avec une caractéristique des lignées contrôles et les variants avec une radiosensibilité intermédiaire. L’analyse systématique des conséquences potentielles des mutations putativesBRCA1/2 introniques et exoniques sur l’épissage des transcritsBRCA1 etBRCA2a de variantsmis en évidence un petit nombre provoquant des anomalies d’épissage, avec seulement un variant sur 38 testés ayant cet effet. Un test complémentaire, l’analyse de la perte d’hétérozygotie aux lociBRCA1 etBRCA2 les tissus dans tumoraux des porteuses de mutations putativesBRCA1/2, s’est avéré impossible du fait d'une forte dégradation de l’ADN par le fixateur de Bouin (acide picrique) utilisé pour la fixation des tissus tumoraux disponibles pour notre étude. L’ensemble des résultats de notre étude suggère que certains variants rares faux-sens et introniquesBRCA1 etBRCA2 aux correspondre, présents chez des patientes atteintes de cancer du sein précoce, peuvent véritables mutations affectant la fonction de ces gènes. Mots clés : cancer du sein, gènesBRCA1etBRCA2, mutation, radiosensibilité, épissage.
TABLE DES MATIERES
ABREVATIONS
.
. p. 1 INTRODUCTION
.
.. p. 2 BIBLIOGRAPHIE
. p. 4 1. RAPPELS SUR LA CANCEROGENESE
.p. 4 2. GENERALITE SUR LE CANCER DU SEIN
.. p. 6 2.1. Epidémiologie
. p. 6 2.2. Les facteurs de risque
.. p. 7 2.2.1. Facteurs environnementaux et hormonaux
..
p. 8 2.2.2. Facteurs génétiques
..
.... p. 9 3. GENES DE PREDISPOSITION AU CANCER DU SEIN
.
. p. 11 3.1. Clonage des gènesBRCA1etBRCA2et leurs caractéristiques génomiques
p. 11 3.2. Transcrits alternatifs deBRCA1etBRCA2
..
.. p. 15 3.3. Rôles fonctionnels de BRCA1 et BRCA2
p. 15 3.3.1. Rôles fonctionnels de BRCA1
p. 17 3.3.2. Rôles fonctionnels de BRCA2
p. 23
3.3.3. BRCA1 et BRCA2 sont des «caretakers»
.. p. 24 3.4. Contribution des gènesBRCA1 etBRCA2 du formes familiales de cancer aux sein
p. 25 3.5. Pénétrance des mutations surBRCA1etBRCA2
..
p. 27 3.6. Implication des mutations surBRCA1 etBRCA2 la survenue du cancer dans du sein précoce
. p. 27 3.7. Spectre de mutations des gènesBRCA1etBRCA2
.
.. p. 31 3.7.1. Mutations délétères
p. 32 3.7.2. Mutations putatives
p. 33 PROJET
... p. 37 1. RESULTATS ANTERIEURS
. p. 37 2. BUT SPECIFIQUE DE L’ETUDE
.. p. 38 3. RETOMBEES ATTENDUES
. p. 39 MATERIEL ET METHODES
p. 40 1. PATIENTES ET PRELEVEMENTS BIOLOGIQUES
.
..... p. 40 2. METHODE D’ANALYSE
.. p. 42 2.1. Analyse de la perte d’hétérozygosité aux lociBRCA1 etBRCA2 le tissu dans tumoral
.. p. 42 2.1.1. Extraction d’ADN à partir de tissus fixés au Bouin et paraffinés
.. p. 42 2.1.2. Extraction d'ADN à partir de lymphoblastes
. p. 43 2.1.3. Amplification de fragments d’ADN
... p. 43 2.1.4. Séquençage automatique
p. 45 2.2. Test de sensibilité aux radiations ionisantes, le test des micronoyaux
. p. 46 2.3. Effets sur l'épissage des transcrits
. p. 47 2.3.1. Etablissement de lignées lymphoblastoïdes
... p. 47 2.3.2. Traitement des cellules pour l'extraction d'ARN
... p. 47 2.3.3. Extraction des ARN totaux
p. 48 2.3.4. Rétrotranscription
.
. p. 48 2.3.5. Polymérisation en chaîne
... p. 49 2.3.6. Prédiction de sites d'épissage
. p. 49
RESULTATS
.. p. 50 1. ANALYSE DE LA PERTE D’HETEROZYGOTIE AUX LOCIBRCA1 ETBRCA2 LES DANS TUMEURS DU SEIN DES PORTEUSES DE MUTATIONS PUTATIVESBRCA1 ETBRCA2
.................................................................................. p. 50 1.1. Mise au point de la technique
... p. 50 1.2. Test de perte d’hétérozygotie dans les tissus tumoraux des porteuses de mutations putativesBRCA1etBRCA2
. p. 52 2. TESTS DE LA SENSIBILITE AUX RADIATIONS IONISANTES
. p. 53 2.1. Mise au point des conditions du test des micronoyaux
. p. 53 2.2. Sensibilité aux radiations ionisantes des lignées lymphoblastoïdes contrôles et de lignées lymphoblastoïdes porteuses de mutations BRCA1 ou BRCA2
... p. 58 2.3. Sensibilité aux radiations ionisantes des mutations putativesBRCA1etBRCA2.. p. 62 3. TESTS D'EPISSAGE DES TRANSCRITSBRCA1OUBRCA2
p. 65 DISCUSSION
. p. 67 CONCLUSION ET PERSPECTIVES
.. p. 72 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUE
. p. 74 ANNEXES : Annexe A incluses dans la Extraction d’ADN à partir de coupes de tissus fixées au Bouin et : paraffine Annexe B: Protocole d'extraction d'ADN à partir du kit "Genomic DNA Isolation" de PUREGEN Annexe Cla PCR à partir de l'ADN extrait des tissus: Protocole de Annexe D: Liste des amorces utilisées pour la PCR à partir des ADNs extraits des tissus Annexe E: Séquençage capillaire Annexe F: Culture cellulaire Annexe G: Test des micronoyaux sur des lignées lymphoblastoïdes Annexe H: Traitement des cellules à la puromycine Annexe I: Protocole d'extraction des ARN totaux par le mini kit RNeasy Annexe J: Transcriptase reverse. Annexe K: Réaction de PCR à partir d'ADNc Annexe L: Amorces pour les insertions ou délétions de petites tailles
Annexe M Protocole de mise au point de l’extraction d’ADN à partir de tissus fixés : au Bouin et paraffinés Annexe Nmise au point du test des micronoyaux: Résultats de la ABREVATIONS ADN : Acide DésoxyriboNucléique ADNc : Acide DésoxyriboNucléique Complémentaire ARN : Acide RiboNucléique AT : Ataxie-Telangiectasie ATM : Ataxia Telangiectasia Mutated BARD1 : BRCA1-Associated Ring Domain gene 1 BET : Bromure d'EThidium BIC : Breast cancer Information Core database BRCA : BReast CAncer genes BRCA1 : BReast CAncer gene 1 BRCA2 : BReast CAncer gene 2 BRCT : BRCA1 Carboxyl-Terminus CBPI : Cytokinesis Block cell Proliferation Index ou index de prolifération de cellules dont la division cytoplasmique a été bloquée DHPLC : Denaturation High Performance Liquid DMEM : Dulbecco's Modified Eagle Medium DMSO : diméthylsulfoxyde EBV : Epstein Barr Virus EDTA : Ethylène Diamine Tétra-Acétate dNTP : désoxynucléotide-5’-triphosphate ddNTP : 3’-didésoxynucléotide-5’-triphosphate IFD : In Frame Deletion ou ne décale pas le cadre de lecture IVS : intervening sequence ou intron kb : kilobase kD : kilodalton LOH : loss of heterozygoty ou perte d'hétérozygotie MN : micronoyaux NES : Nuclear Export Sequence ou séquence d'export nucléaire NLS : Nuclear Localization Sequence ou séquence de localisation nucléaire NMD : Non-Sense Mediated Decay ORF : Open Reading Frame ou Cadre ouvert de lecture PBS : phosphate buffer saline ou tampon phosphate salin PCR : Polymerase Chain Reaction ou réaction de polymérisation en chaîne RPMI : Roswell Park Medium Institut RT : transcriptase reverse SVF : sérum de veau foetal TBE : Tris borate EDTA TE : Tris-EDTA TNE : Tris-NaCl-EDTA Tm : melting temperature ou température de fusion UTR : Untranslated region ou région non transcrite UV : ultra violet UVs : variants of unknown significance ou variants d'une signification biologique inconnue Nomenclature : - Les gènes sont indiqués en italique (BRCA1) - Les protéines sont indiquées en lettres droites (BRCA1) INTRODUCTION
Les découvertes récentes de la génétique moléculaire ont révolutionné le dépistage des maladies génétiques en permettant la détermination précise des sites à l’origine des maladies héréditaires, c’est à dire les gènes ainsi que leurs anomalies. La mise en évidence de nombreux gènes à l’origine de la prédisposition héréditaire aux différentes pathologies a pu être réalisée par l’intermédiaire d'études de liaison génétique et de clonage positionnel. L'approche consiste à construire des cartes génétiques et physiques de la région, à définir la localisation chromosomique, puis à identifier les gènes de la région pour mettre en évidence le gène en cause. Le clonage positionnel a permis l’identification de gènes impliqués dans la prédisposition au cancer du sein,BRCA1(Breast Cancer 1) en octobre 1994 (Miki et al., 1994) etBRCA2(Breast Cancer 2) en décembre 1995 (Woosteret al., 1995). Les premières études réalisées sur les gènesBRCA1etBRCA2 mettaient en évidence des mutations entraînant un codon stop prématuré (Mikiet al., 1994 ; Gaytheret al., 1995 ; Serovaet al., 1996 ; Woosteret al., 1995 ; Tavtigianet al., 1996). Puis, d’autres études ont montré la présence de variants de séquenceBRCA1etBRCA2 appelés variants d'une signification biologiquefaux-sens et introniques inconnue (Stoppa-Lyonnetet al., 1997 ; Hakanssonet al., 1997 ; Petoet al., 1999). Dans les publications, ces mutations putatives sont très peu décrites ou non reportées car leurs interprétations sont difficiles. Il est donc délicat d’estimer la proportion de ces variants dans le spectre des mutations BRCA1etBRCA2celle de notre laboratoire, réalisée sur deux. Cependant, selon certaines études, dont séries de populations de cancer du sein précoce, les mutations putativesBRCA1etBRCA2sont aussi nombreuses que les mutations tronquantesBRCA1 etBRCA2 est, clairement délétères. Ainsi, il important de définir quelles variations de séquenceBRCA1 etBRCA2 aux véritables correspondent mutations, afin, d’une part, de préciser le rôle deBRCA1etBRCA2dans la cancérogenèse mammaire et, d’autre part, de pouvoir fournir un conseil génétique aux porteuses de ces variants. Ce projet a pour but d’estimer la contribution des mutations putativesBRCA1 etBRCA2 dans la survenue du cancer du sein précoce en évaluant la signification de ces variants rares identifiés dans notre étude de cancer du sein précoce réalisée sur des populations française et espagnole. L’évaluation des conséquences biologiques des mutations putativesBRCA1 etBRCA2 effectuée grâce à une est série de tests, afin d’attribuer à chaque mutation putative une probabilité d’être une mutation délétère ou un polymorphisme neutre.
BIBLIOGRAPHIE
1. RAPPELS SUR LA CANCEROGENESE
A l'origine d'une tumeur, se trouve une ou quelques cellules qui ont subis des changements génétiques menant à des caractéristiques de croissance et de morphologie différentes des cellules normales. Les critères conduisant à la malignité d'une cellule sont : l'augmentation de la prolifération cellulaire, la perte de différenciation, la capacité d'infiltration et donc de création des métastases dans d'autres organes que celui dont la première cellule transformée provient. La cellule va connaître plusieurs altérations phénotypiques qui sont : la perte de dépendance aux facteurs de croissance, la perte de dépendance à l'ancrage, la perte du contrôle du cycle cellulaire, la résistance à l'apoptose, les modifications des molécules de surface, les modifications de l'adhésion cellulaire, les altérations de la différenciation, les mécanismes de transduction de signal, et également les altérations génétiques qui en sont à l'origine. La transformation en cellule maligne est un processus multi-étapes, qui progresse souvent d'une lésion bénigne en une lésion maligne. Ce développement est causé par l'accumulation d'altérations dans les gènes responsables du contrôle de la prolifération cellulaire, de la mort cellulaire, du maintien de l'intégrité du génome ou d’autres fonctions clés. Le développement du cancer peut être initié par des agents environnementaux (agents chimiques, radiations, virus) et par des facteurs d'hérédité génétique (mutations germinales).
2. GENERALITES SUR LE CANCER DU SEIN 2.1. Epidémiologie Dans les pays industrialisés, le cancer du sein représente un cancer sur quatre chez la femme, c’est le cancer le plus fréquent chez celle-ci. Il est estimé qu’une femme sur dix en sera atteinte dans sa vie. En France, l’incidence, c’est-à-dire le taux d’apparition annuel de nouveaux cancers du sein est de 83 pour 100 000 femmes soit 37 000 nouveaux cas chaque année. Les dernières estimations suggéreraient que plus d’un million de nouveaux cas de cancer du sein (1 050 000 cas) apparaissent chaque année dans le monde, avec près de 580 000 cas dans les pays les plus développés contre 470 000 dans les pays les moins développés (Globocan, 2000). Dans la population générale, le cancer du sein est rare avant 30 ans, puis l’incidence augmente rapidement avec l’âge. 2.2. Facteurs de risque De nombreux facteurs de risque se lient pour induire le cancer du sein, c’est plus exactement l’interaction entre les gènes de prédisposition et les facteurs hormonaux, environnementaux et nutritionnels qui sont à l’origine de la cancérogenèse.
2.2.1. Facteurs environnementaux et hormonaux Age Le cancer du sein est rare avant 30 ans et sa fréquence maximale se trouve entre 50 et75 ans. L’incidence est de 41,9/100 000 habitants/an entre 15 et 44 ans et atteint 268,0/100 000 habitants/an après 65 ans (Globocan, 2000).
Facteurs hormonaux Le risque évolue suivant la durée de stimulation de la glande mammaire par les hormones sexuelles. En effet, il a été démontré que des premières règles tardives ou une ménopause précoce diminuaient le risque de cancer. Au contraire, une première grossesse tardive ou la nulliparité augmenteraient le risque (pour revue, Kelseyet al., 1993). L’allaitement prolongé (plus de six mois) aurait un léger effet protecteur (Lipworthet al., 2000 ; Collaborative Group on Hormonal Factors in Breast Cancer, 2002). Le risque engendré par la contraception orale n’est pas très clair, un certain nombre d’études décrivent une augmentation du risque alors que d’autres ne distinguent aucun lien. Enfin, le traitement hormonal post-ménopausique de longue durée augmenterait légèrement le risque (IARC monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans, vol. 72, 1999). Facteurs nutritionnels et le mode de vie L’incidence du cancer du sein varie cinq fois entre les pays industrialisés et les pays moins développés. Le mode de vie occidental, caractérisé par une faible dépense énergétique et des régimes riches en lipides et protides, jouerait un rôle par le biais de l’élévation de la production d’œstrogène. Il a été montré que les Japonaises immigrées depuis 10 ans aux Etats-Unis ont une incidence du cancer du sein qui augmente pour rejoindre celui de la population américaine au bout d’une ou deux générations (Ziegleret al., 1993). Au contraire, la consommation élevée de fruits et légumes diminuerait le risque de cancer du sein (IARC Handbooks of Cancer Prevention vol.8, 2003). Irradiation et agents physiques ou chimiques Les radiations ionisantes émises lors de certains examens médicaux par exemple, peuvent augmenter le risque de cancer du sein (Marcuset al., 2000). Il est également possible que des produits cancérigènes ou encore des molécules de structure voisine des œstrogènes tel que le DTT (dichlorodiphenyltrichloroéthane) aient un rôle dans la cancérogenèse mammaire. 2.2.2. Facteurs génétiques Le cancer du sein est la plupart du temps sporadique mais il est estimé que 10% ont une composante héréditaire forte à transmission autosomique dominante (Newmanet al., 1988 ; Easton & Peto, 1990).
Plusieurs études sur des familles à cas multiples de cancer du sein ont montré que le risque était de deux lorsque des membres de la famille au premier degré sont atteints (mère, sœur) (pour revue, Pharoahet al., 1997). Le risque diminue lorsque ce sont des membres de la famille au second degré qui ont développé un cancer du sein (grand-mère, tante). Cependant, le risque s’accroît si plusieurs personnes sont touchées dans la famille et d’autant plus si l’âge de survenue du cancer est jeune. D’après une étude sur des populations nord américaine et européenne, la probabilité qu’une femme développe un cancer du sein avant l’âge de 50 ans est de 1,7%, 3,7% et 8,0% si respectivement elle a zéro, une ou deux parentes du premier degré atteintes d’un cancer du sein (Collaborative Group on Hormonal Factors in Breast Cancer, 2001). Dans plusieurs familles à risque, des cancers bilatéraux et des cancers de l’ovaire sont fréquents (Schildkrautet alLes facteurs héréditaires des cancers du sein et de l’ovaire sont donc liés.., 1989). 3. GENES DE PREDISPOSITION AU CANCER DU SEIN Plusieurs gènes dont les mutations germinales prédisposent au cancer du sein ont été identifiés. Ces gènes se dissocient en deux groupes distincts, les gènes majeurs de prédisposition au cancer du sein BRCA1etBRCA2, souvent responsables de la cancérogenèse mammaire dans les cas héréditaires, et les gènes mineurs de prédisposition au cancer du sein, le gènep53, le gènePTENet le gèneATMqui sont impliqués dans des formes de cancer du sein héréditaires rares.
3.1. Clonage des gènesBRCA1etBRCA2et leurs caractéristiques génomiques Le gèneBRCA1 17, au(BReast CAncer 1) a été mis en évidence sur le bras long du chromosome locus 17q21 par Mikiet al. en octobre 1994 comme étant un gène de prédisposition au cancer du sein. Il possède 22 exons codants dont un très grand, l'exon 11 de 3 426pb représentant 61% de la séquence codante La partie codante deBRCA1 une longueur de 5 592 pb étendue sur 81 kb d’ADN génomique. Le a gèneBRCA1possède une quantité importante de séquences répétitives Alu dans ses introns (41,5%), ces séquences sont connues pour favoriser les événements de recombinaison. Dans sa partie 5’UTR (UnTranslated Region),BRCA1est "tête-bêche" avec le gèneNBR2(NearBRCA1gene 2), avec qui il possède un promoteur bidirectionnel en commun (Xu C.F.et al., 1997). Un pseudogène deBRCA1 (ψBRCA1 en amont de situe à 44,5kbexons 1a, 1b et 2 se), constitué d'un tandem de duplication des BRCA1 (Brownet al., 1996 ; Pugetet alfonctionnalité de ce gène et l'existence d'une., 2002). La "pseudo-protéine" BRCA1 n'ont pas été démontrées. Le gèneBRCA2 a été mis en évidence sur le bras long du chromosome(BReast CAncer 2) 13, au
locus 13q12-13 par Woosteret al. en 1995 et par Tavtigianet al. en 1996 comme étant le second gène de prédisposition au cancer du sein. Ce gène comporte 27 exons dont 26 codants, d’une longueur de 10 257 pb, étendue sur 84 kb d’ADN génomique.BRCA2 11 de grandes des exons 10 et possède tailles, respectivement 1 116pb et 4 932pb, représentant 59% de la partie codante et 48% juste pour l'exon 11. 3.2. Transcrits alternatifs deBRCA1etBRCA2 Plusieurs pré-messagers deBRCA1 susceptibles de subir un épissage alternatif on été mis en évidence. Un transcrit ne possédant pas la majeure partie de l'exon 11 (conservation des 118 premiers nucléotides : partie 11a de l'exon) est exprimé dans les cellules épithéliales mammaires humaines normales ou malignes et est nomméBRCA1-D11b (Luet al., 1996). Deux autres transcrits, BRCA1-D9, 10etBRCA1-D9, 10, 11b, conduisent à des expressions ubiquitaires de leurs protéines (Mikiet al., 1994 ; Luet al.,1996) mais leurs rôles restent inconnus. Tout commeBRCA1, les pré-méssagers deBRCA2 épissés alternativement. Un sont transcrit, BRCA2-D3, ne possédant pas l'exon 3 c'est-à-dire le domaine d'activation transcriptionnelle, a été caractérisé (Zouet al. 12,Un second transcrit dépourvu de l'exon, 1999). BRCA2-D12, a également été mis en évidence et son expression serait plus élevée dans les cellules issues de tumeurs mammaires (Bièche et Lidereau, 1999). Le rôle biologique de ces deux variants reste à déterminer. 3.3. Rôles fonctionnels de BRCA1 et BRCA2 Les protéines BRCA1 et BRCA2 sont présentes dans de nombreux tissus incluant les seins et les ovaires où leur localisation est essentiellement nucléaire, et leur expression est maximale pendant la phase S du cycle cellulaire (Venkitaraman, 2002). Ces deux protéines jouent un rôle dans le maintien de l’intégrité de l’ADN. Il est cependant difficile de déterminer quels sont précisément leurs rôles car ces protéines sont impliquées dans de nombreux processus tels que la réparation des cassures double brins de l’ADN lors des voies de réparation par recombinaison homologue pour BRCA1 et BRCA2 et par recombinaison non homologue pour BRCA1, le contrôle du cycle cellulaire et la transcription. Une copie défectueuse deBRCA1 ouBRCA2 la lignée germinale est à l’origine dans d’une prédisposition au cancer mais le second allèle n’est perdu que par la suite, dans les cellules qui deviendront alors tumorales. Ces gènes sont donc des suppresseurs de tumeurs. 3.3.1 Rôles fonctionnels de BRCA1 Le domaine en doigts de zinc
