APPROCHE PROTEOMIQUE DE L'EXPRESSION DU GENE
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Niveau: Supérieur
MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE Présenté Par MARIE ALEXANDRA ALBARET Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes TITRE : APPROCHE PROTEOMIQUE DE L'EXPRESSION DU GENE crmp2 Laboratoire EPHE : Biologie cellulaire quantitative Université montpellier II – INSERM EMI 0012 Case courrier 103 – Place E . Bataillon 34095 Montpellier cedex 5 Responsable EPHE : Dr M. Rossel E mail : Laboratoires d'accueil : 1- Neurobiologie expérimentale et physiopathologie Faculté Laennec – unité INSERM 433 8 Rue Guillaume Paradin 69372 Lyon cedex 08 Responsable : Dr M-F. Belin E mail : EPHE Banque de Monographies SVT 1
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MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE Présenté Par MARIE ALEXANDRA ALBARET Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes TITRE : APPROCHE PROTEOMIQUE DE L'EXPRESSION DU GENE crmp2 Laboratoire EPHE : Biologie cellulaire quantitative Université montpellier II – INSERM EMI 0012 Case courrier 103 – Place E . Bataillon 34095 Montpellier cedex 5 Responsable EPHE : Dr M. Rossel E mail : Laboratoires d'accueil : 1- Neurobiologie expérimentale et physiopathologie Faculté Laennec – unité INSERM 433 8 Rue Guillaume Paradin 69372 Lyon cedex 08 Responsable : Dr M-F. Belin E mail : EPHE Banque de Monographies SVT 1
- cluster des gènes méta-homéotiques
- crmp2
- gène crmp2
- séparation en première dimension……………………………………………………
- crmp2 dans le foie de souris adulte………………………………………………
- protéines crmp
- dimères de tubuline dans les cellules nerveuses
- système nerveux
- évènements cellulaires
MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L’EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre
MEMOIRE Présenté Par MARIE ALEXANDRA ALBARET Pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes TITRE : APPROCHE PROTEOMIQUE DE L’EXPRESSION DU GENE crmp2
Laboratoire EPHE : Biologie cellulaire quantitative Université montpellier II INSERM EMI 0012 Case courrier 103 Place E . Bataillon 34095 Montpellier cedex 5 Responsable EPHE : Dr M. Rossel E mail : mrossel@univ-montp2.fr Laboratoires d’accueil : 1- Neurobiologie expérimentale et physiopathologie Faculté Laennec unité INSERM 433 8 Rue Guillaume Paradin 69372 Lyon cedex 08 Responsable : Dr M-F. Belin E mail : belin@laennec.univ-lyon1.fr
2- Régulation post-transcriptionnelle de l’expression génique Université lyon 1 UMR CNRS 5534 43 bd du 11 novembre 1918 69622 Villeurbanne cedex Responsable : Dr J.J Diaz E mail : diaz@cgmc.univ-lyon.fr Résumé Les protéines CRMP pour «Collapsin Response Mediator Protein » sont codées par une famille de cinq gènes crmp1, crmp2, crmp3, crmp4 et crmp5 localisés sur cinq chromosomes distincts. Les gènes crmp ont été conservés au cours de l’évolution et appartiennent au cluster des gènes métaHOX impliqués dans le développement [15]. Leur expression a d’ailleurs été mise en évidence, lors de l’embryogenèse, dans le cerveau de rat en développement [57]. Les nombreuses données bibliographiques accumulées à ce jour présentent CRMP2 comme une protéine spécifique au système nerveux central [57] [26] pouvant se lier aux dimères de tubuline et induire leur polymérisation [19]. Par ailleurs, ces données suggèrent que CRMP2 aurait un rôle dans la différenciation [1] et la plasticité cellulaire [60]. Lors de ces évènements, CRMP2 pourrait jouer le rôle de molécule relais entre les signaux extra-cellulaires et le cytosquelette par des mécanismes moléculaires non encore décryptés. Pour appréhender ces mécanismes moléculaires, il est nécessaire de connaître les formes protéiques par lesquelles le gène crmp2 s’exprime et leur implication lors d’évènements cellulaires physiologiques et pathologiques. C’est pourquoi nous avons mis en place une approche protéomique de l’expression de crmp2 par électrophorèse bidimensionnelle, western-blot (WB) et spectrométrie de masse (MS) de manière systématique sur des tissus sains et de tissus tumoraux. Il ressort de cette étude que le gène crmp2 s’exprime selon au moins une 30 aine de formes protéiques différentes. L’analyse protéomique de ces formes montre qu’elles peuvent être classées en trois groupes que l’on retrouve dans tous les tissus étudiés. Le Groupe n°1 rassemble les formes dont le pHi est proche du pHi théorique de CRMP2, le Groupe n°2 les formes dont le pHi est plus acide que le pHi théorique et le groupe n°3 les formes dont le pHi est plus basique. Le Groupe n°1 est constitué de 8 formes identifiées sans ambiguité comme CRMP2 par MS. Trois d’entre elles sont présentes dans l’ensemble des tissus étudiés, lorsque les 5 autres sont présentes uniquement dans le système nerveux central. A ce jour, les protéines des groupes n°2 et n°3 ont été identifiées comme CRMP2 par WB mais pas encore confirmées par MS. Une variation de l’expression des formes acides du Groupe n°2 a clairement été mise en évidence dans les deux modèles tumoraux. Les formes basiques du groupe n° 3 ont été mises en évidence dans le noyau. Ainsi, nous pouvons dire que le gène crmp2 au travers de ses 30 formes protéique est le support d’une fonction ubiquiste, d’une fonction spécialisée au système nerveux central, et semble t-il d’une fonction nucléaire. De plus, sa fonction en lien avec le cytosquelette pourrait se réaliser au travers ses formes acides. Table des matières 1 INTRODUCTION
5 2 MATERIELS ET METHODES
16 2-1 Préparation des échantillons
6 1 2-1-1 Traitements des tissus et cellules
16 2-1-2 Préparations des échantillons
.. 18 2-2 Séparation des protéines par électrophorèse bidimensionnelle
18 2-2-1 Tampons
.. 18
2-2-2 Séparation en première dimension
.. 19 2-2-3 Séparation en deuxième dimension
. 19 2-3 Détection des protéines
. 20 2-3-1 Coloration à l’argent
20 2-3-2 Coloration au bleu de Coomassie colloïdal
. 20 2-3-3 Western-blot.................................................................................................................... 21 2-3-4 Anticorps anti-CRMP2.................................................................................................... 22 2-4 Identification des protéines par spectrométrie de masse
. 22 2-4-1 Découpe des tâches d’intérêts
. 22 2-4-2 Analyse des peptides par spectrométrie de masse
.. 22 2-4-3 Identification des protéines
. 23 2-5 Fractionnement cellulaire
24 3 RESULTATS
... 25 3-1 Construction de cartes protéomiques bidimensionnelles de CRMP2
.. 25 3-1-1 Formes de CRMP2 révélées par les deux types d’anticorps anti-CRMP2, « pep4 » et « C ter » après électrophorèse bidimensionnelle
.. 25 3-1-1-1 Cerveau de souris adulte
. 25 3-1-1-2 Lignée de Lymphocytes T humains chroniquement infectés par HTLV-I
28 3-1-2 Identification par spectrométrie de masse des formes de CRMP2 reconnues par les anticorps « pep4 » et « Cter »
... 29 3-1-2-1 Formes cérébrales de CRMP2
. 29 3-1-2-2 Formes lymphocytaires de CRMP2
. 31 3-2 Expression différentielle de CRMP2 en fonction du stade de développement, de la nature du tissu, et de l’état de tumoriginicité de la cellule
. 32 3-2-1 Analyse comparative de l’expression de CRMP2 dans le cerveau d’embryon de souris, dans le poumon et le foie de souris adulte
32 3-2-1-1 CRMP2 dans le cerveau d’embryon de souris
. 32 3-2-1-2 CRMP2 dans les poumons de souris adulte
34 3-2-1-3 CRMP2 dans le foie de souris adulte
.. 34 3-2-2 Analyse comparative de l’expression de CRMP2 dans deux types de tissus tumoraux issus du sang et du rein humain
35 3-2-2-1 CRMP2 dans les lymphocytes T tumoraux
.. 35 3-2-2-2 CRMP2 dans les cellules rénales tumorales
37 3-3 Localisation intra-cellulaire de CRMP2
38
58
4 DISCUSSION
.. 40 CRMP2 est exprimée sous des formes protéiques variées dans divers tissus de différentes espèces
40 Caractérisation de l’expression de crmp2
. 42 Formes de CRMP2 et modifications post-traductionnelles
.. 43 Formes de CRMP2 et épissage différentiel
.. 45 Des variants de CRMP2 pourraient présenter des pHi plus acides et plus basiques que le pHi théorique
... 47 CRMP2 co-migre-t’elle avec la vimentine et la tubuline en électrophorèse bidimensionnelle?
48 CRMP2 se lie préférentiellement aux dimères de tubuline dans les cellules nerveuses et à la vimentine dans les lymphocytes
... 49 Les formes basiques de CRMP2 semblent ne plus posséder d’extrêmité C terminale
. 51 Les formes basiques de CRMP2 sont localisées dans le noyau
52 Fonction possible de CRMP2 : régulateur de la polarité du cytosquelette dans les cellules nerveuses
.. 54 5 CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES
. Liste des abréviations ADN : acide desoxyribonucléotidique ATLL : HTLVAssociated Leukemia Lymphoma ARN : acide ribonucléotidique ARNm : Acide RiboNucléotidique méssager BMP4 : Bone Morphogenetic Protein 4 CaM kinase II: protéine kinase II Ca 2+ / calmoduline dépendante Cdk5 : Cyclin dependent kinase 5 CHAPS : cholamidopropyl-diméthylammonio-1-propane sulfonate Cluster HOX : cluster des gènes homéotiques Cluster métaHOX : cluster des gènes méta-homéotiques CRMP: protéine « Collapsin Response Mediator Protein » Crmp : gène « Collapsin Response Mediator Protein » « Cter » : anticorps anti-CRMP2 C terminal DHPase: dihydropyrimidinase DTE : 1,4-dithioérythritol FHA : Filaments Hélicoïdaux Appariés GaPDH : glycéraldéhyde 3 phosphate déshydrogénase GDP : Guanosine diphosphate GSK-3: Glycogen Synthase Kinase 3 GTP : guanosine triphosphate hnRNP D : heterogenous nuclear RiboNucleoProtein D HOX: homéotiques HSP : Heat Shock Protein HTLV-I : Human T.Lymphotropic Virus-I IAA: iodoacétamide IPG buffer: Immobilized PH Gradient buffer
kDa : kilo Dalton LPA : lysophosphatidic acid MALDITOF : Matrix-Assisted, Laser Desorption/Ionisation Time Of Flight MAP : Microtubule Associated Protein MétaHOX : méta-homéotique MS : Mass spectroscopy MS/MS : spectrométrie de masse en tandem MTOC : MicroTubule-Organizing Center NGF : Nerve Growth Factor NLS: Nuclear Localisation Signal NO: nitric oxide NP-1: Neuropiline-1 PAGE : PolyAcrylamide Gel Electrophoresis « Pep4 » : anticorps anti-CRMP2 peptide 4 pHi : pH isoélectrique PlexA1 : Plexine A1 pnr : gène pannier PSD: Post-Synaptic Density PVDF : polyvinylidinedifluoride SAM-P8: Senescence accelerated mouse P8 SDS : sodium dodécyl sulfate Sema3A : sémaphorine 3A ser : sérine sHSP : small Heat Shock Protein TBST : Tris Buffer Saline Tween thr : thréonine TUC-2b : TOAD/Ulip/CRMP 2b unc-33 : gène uncoordinated-33 WD: tryptophane-aspartate Introduction Bibliographique Les protéines CRMP pour «Collapsin Response Mediator Protein» sont codées par une famille de cinq gènes : crmp1, crmp2, crmp3, crmp4 et crmp5 . Leur mise en évidence débute en 1995 par la découverte simultanée de CRMP2 lors de deux études parallèles. Dans les racines dorsales des ganglions de poussin, CRMP2 a été caractérisée comme effecteur intracellulaire du signal de collapse du cône de croissance des axones induit par la molécule extracellulaire sémaphorine 3A (Sema3A). La protéine CRMP2 transduit le signal de collapse au niveau de la cascade de signalisation intracellulaire. Ceci est à l’origine de son nom : « Collapsin Response Mediator Protein » (CRMP) [22]. CRMP2 a également été isolée et clonée au cours d’une étude portant sur les protéines fortement et spécifiquement synthétisées lors du développement du système nerveux chez le rat [42]. La protéine CRMP4 a été isolée l’année suivante, en 1996, grâce à une étude centrée sur une petite protéine phosphorylée : la stathmine [8]. La même année, les protéines CRMP1, 2 et 4 ont été mises en évidence dans le système nerveux par Hamajima et ses collaborateurs lors d’une étude sur des
protéines homologues à une enzyme du foie, la dihydropyrimidinase. Cette enzyme présente d’ailleurs entre 60 % de similitude avec les CRMP [26]. La protéine CRMP3 a été isolée du cerveau de rat par Tam Quach au laboratoire Inserm U433 de Marie-Françoise Belin en 2000 [46]. Dans ce même laboratoire, des travaux sur les syndromes neurologiques paranéoplasiques ont permis de découvrir que des protéines CRMP peuvent être des auto-antigènes. C’est ainsi que la protéine CRMP5 a été identifiée comme un auto-antigène majoritaire [49].
Expression des crmp lors du développement Les gènes crmp sont conservés au cours de l’évolution. Nous pouvons observer jusqu’à 95% de similitude entre les gènes crmp humain et murin [8]. La plupart des organismes se développent selon une segmentation organisée en deux axes de symétrie antéro-postérieur et dorso-ventral. Cette segmentation organisée dans le temps et l’espace est dirigé par le cluster des gènes homéotiques (gènes HOX). Ceux-ci ont été particulièrement bien étudiés chez la drosophile où ils se situent en deux complexes sur le chromosome 3R dans la région 84 à 89. Ces gènes ont été dupliqués au cours de l’évolution des vertébrés et se retrouvent dans des régions paralogues chez l’homme réparties sur les quatre chromosomes 2q, 7p, 12q et 17q [4]. Ces régions constituent le cluster des gènes HOX, (cluster HOX). Chez la drosophile, l’unique gène crmp se situe également sur le chromosome 3R de la drosophile dans la région 83 qui jouxte la région des gènes HOX (84 à 89). Le gène crmp a subit une évolution parallèle à celle des gènes HOX au cours de l’évolution des vertébrés. Il a été dupliqué et se retrouvent dans des régions paralogues chez l’homme. Les protéines CRMP1, 2, 3 et 4 présentent d’ailleurs 75% de similitude entre elles [7] et ont de fortes analogies biochimiques. Ces régions composent le cluster des gènes métaHOX. Le cluster métaHOX regroupe quatre chromosomes différents du cluster HOX. Ces régions sont sur les chromosomes 4p, 8p ou 2p, 5q et 10q [15]. Le gène crmp1 se trouve dans la région chromosomique 4p15, le gène crmp2 dans la région chromosomique 8p21, le gène crmp3 dans la région 10q26, le gène crmp4 dans la région 5q32. Seul, crmp5 reste exclu du cluster en se situant dans la région chromosomique 5b1. D’un point de vue phylogénétique, crmp5 est d’ailleurs séparé des autres gènes crmp . La protéine CRMP5 présente seulement 50% de similitude avec les quatre autres protéines CRMP [20]. Les copies des gènes crmp1, crmp2, crmp3 et crmp4 appartiennent donc au cluster métaHOX. Il a été fait l’hypothèse que les gènes du cluster métaHOX, qui ne sont pas des gènes homéotiques, entrent en synergie avec les
gènes HOX lors du développement [15]. Par ailleurs, l’ensemble des cinq gènes crmp ont été décrits comme très fortement exprimés au cours du développement. Dans l’embryon de xénope, l’expression de la protéine CRMP2 débute au milieu du stade gastrula. CRMP2 est révélée dans toutes les cellules qui constituent ensuite l’embryon. A partir du stade neurula, la synthèse de CRMP2 se poursuit exclusivement dans les tissus nerveux. CRMP2 est alors exprimée lors de la formation de la plaque et du tube neural. A des stades ultérieurs, CRMP2 est ensuite exprimée dans le cerveau, la moelle épinière et les yeux [35]. Dans le cerveau de rat en développement, il a été mis en évidence une forte expression des cinq CRMP selon un profil d’expression spatio-temporel différent pour chaque CRMP [57]. La conservation de la séquence nucléotidique des gènes crmp au cours de l’évolution se traduit, comme nous l’avons vu, par une conservation de la séquence peptidique des protéines CRMP issues de l’expression de ces gènes. Cette conservation peut également être appliquée à la structure tridimensionnelle des CRMP. Leur structure tridimensionnelle a été analysée au travers de CRMP1 par crystallographie. Les cinq protéines CRMP se présentent donc sous la forme d’une structure bilobée comparable à un « poumon » [17].
Expression des crmp lors de la différenciation et de la plasticité cellulaire L’expression des protéines CRMP est maximale durant la première semaine après la naissance, lorsque la maturation des neurones et les connections synaptiques sont très actives [43] [8]. Dans le cerveau adulte, la synthèse des cinq protéines CRMP chute de manière drastique, mais subsiste dans des zones de forte neurogénèse et/ou plasticité tels que le bulbe olfactif, l’hippocampe et le cervelet. Ainsi, l’ARN messager (ARNm) de crmp1 est principalement détecté dans les cellules de Purkinje du cervelet [50]. Parmi les cinq CRMP, CRMP2 est la protéine dont le taux de synthèse dans le cerveau adulte est le plus élevé [50]. Elle est particulièrement détectée dans le système olfactif [45], dans l’hippocampe et le cervelet [50]. L’ARNm de crmp3 est mis en évidence dans les cellules de la couche granulaire du cervelet, l’olive inférieure et le gyrus denté de l’hippocampe [46]. CRMP4 est également présente dans le bulbe olfactif l’hippocampe en formation et dans les cellules de la couche , granulaire inférieure [44]. CRMP5 est mis en évidence dans quelques neurones post-mitotiques du bulbe olfactif, dans l’épithélium olfactif [34] et dans le gyrus denté de l’hippocampe [49]. Les CRMP
présentent 30% de similitude avec la protéine du gène uncoordinated-33 ( unc-33 ) exprimée chez le mutant non coordonné du nématode Caenorhabditis elegans . [8]. Ce gène est impliqué dans le contrôle du guidage et de la croissance axonal. L’expression de unc-33 muté affecte spécifiquement les microtubules neuronaux dans leur diamètre et leur forme [28]. L’homologie structurale entre crmp2 et unc-33 conduit à la possibilité que CRMP2 puisse jouer un rôle dans le guidage et la croissance axonale de manière similaire à unc-33 [36]. L’ensemble de ces observations suggère très fortement l’implication des gènes crmp dans la différentiation et la plasticité des cellules nerveuses. Expression de crmp2 lors de la différenciation et de la plasticité cellulaire Parmi les différentes CRMP, l’implication de CRMP2 dans ces deux évènements cellulaires a été particulièrement bien mis en évidence. L’implication de CRMP2 dans la différentiation cellulaire des cellules nerveuses a bien été établie. L’expressio n de crmp2 dans le système nerveux survient précisément lorsque les neurones post-mitotiques commencent à se différencier et à migrer. La capacité plastique des cellules nerveuses permet alors la formation de connections entre les différentes parties du cerveau. Notamment, ce sont dès les premiers stades de la différenciation du neuroblaste que crmp2 est exprimé au niveau de l’axone en croissance [1]. Le taux d’expression de CRMP2 chute lorsque la croissance des axones est finie [42]. La synthèse de CRMP2 est fortement augmentée durant la différenciation des cellules de rat PC12 en cellules neuronales induite par le facteur de croissance neuronale (NGF) [36]. Lors de l’induction par l’acide rétinoique de la différenciation de cellules de neuroblastome humain en cellules nerveuses, la transcription de l’ARNm de crmp2 est également fortement augmentée [21]. Le gène crmp chez la drosophile est un répresseur du gène pannier ( pnr ) , lui-même répresseur de gènes pro-neuronaux [9]. Chez le xénope, la transcription de crmp2 est activée par les molécules chordine et noggine, molécules inductices des tissus neuronaux, et est inhibée par la proteine « bone morphogenetic 4 » (BMP4), répresseur de la différenciation neuronale [35]. L’implication de CRMP2 lors du phénomène de plasticité cellulaire a également été particulièrement bien mis en évidence dans les cellules nerveuses. Il a été décrit que CRMP2 est phosphorylée par la protéine kinase II Ca 2+ /calmoduline dépendante (CaM kinase II) dans les densités post-synaptiques (PSD) [61]. Or, les PSD et la CaM kinase II sont impliquées dans la plasticité synaptique. CRMP2 est enrichie dans les axones en croissance des neurones de l’hippocampe en culture et l’augmentation de la synthèse de CRMP2 induit dans ces neurones la
formation de multiples axones. A l’inverse, un dominant négatif de CRMP2 réalisé par la protéine tronquée supprime la formation de l’axone [31]. CRMP2 a été identifiée comme molécule transductrice du signal de collapse induit par Sema3A. Ceci a été mis en évidence par l’observation que la présence d’anticorps dirigés spécifiquement contre CRMP2 lève le phénomène de collapse induit par Sema3A [22]. La famille des sémaphorines, à laquelle appartient Sema3A, constituent une famille majeure dans les signaux de guidage axonal aussi bien dans le système nerveux central que périphérique [48]. Sema3A est à l’origine du collapse des axones par sa fixation sur son complexe récepteur Neuropiline-1 (NP-1) associé à Plexine A1 (PlexA1) [27]. PlexA1 contient un segment intracellulaire qui transduit le signal de Sema3A au niveau de la réorganisation du cytosquelette [38]. PlexA1 est phosphorylée par la protéine Tyrosine kinase Fes. En absence de ligand sur le récepteur NP-1, celui-ci inhibe l’activation par phosphorylation de PlexA1 par Fes. Fes phosphoryle également CRMP2 associée à CRMP5 et pourrait à ce titre constituer un lien entre le complexe récepteur et CRMP2 [40]. Par ailleurs, il a récemment été démontré que CRMP2 est phosphorylée par la protéine kinase 5 cycline dépendante (Cdk5) dans le cadre de la voie de signalisation induite par Sema3A [49]. Le mécanisme moléculaire par lequel CRMP2 s’insère dans la voie de signalisation Sema3A reste encore à découvrir.
Interaction CRMP2 -cytosquelette La forme cellulaire dans sa capacité plastique et sa capacité de différenciation est une réponse à la fois aux modifications du milieu environnant et au déterminisme génétique interne. Dans les cellules eucaryotes, ces capacités sont sous-tendues au niveau moléculaire par des interactions dynamiques entre trois catégories de fibres : les microfilaments d’actine, les filaments intermédiaires et les microtubules. Ces derniers sont un assemblage de sous-unités appelées « hétérodimères de tubuline ». Les hétérodimères sont constitués d’une sous-unité a, d’une sous-unité b et de deux molécules de guanosine triphosphate (GTP). Les hétérodimères sont arrangés en proto-filament tous orientés dans la même direction. Ces derniers s'enchainent et constituent un cylindre polarisé nommé microtubule [16]. Les microtubules sont des polymères dynamiques de tubuline qui oscillent constamment entre des cycles de polymérisation et de dépolymérisation. Cette propriété du microtubule est qualifiée d’instabilité dynamique [39]. C’est cette propriété qui permet de moduler l’organisation spatiale des microtubules dans la cellule lors de la polarisation et de la croissance
cellulaire ou encore de la formation du fuseau mitotique. L’un des modèles actuel pour expliquer l’instabilité dynamique est celui de la coiffe de GTP. Les microtubules polarisés comportent deux extrêmités pour lesquelles la polymérisation est plus ou moins facilité. L'extrêmité (-) n'est pas favorable à la polymérisation et très souvent liée au centre organisateur des microtubules (MTOC). L'extrêmité (+) est au contraire favorable à la polymérisation et est le site de l'élongation du microtubule. Il a été observé que l'extrêmité (+) est stable et favorise la polymérisation lorsque l'extrêmité est riche en molécules de GTP ("extrêmité GTP") ou lorsque la concentration en hétérodimères de tubuline est forte. L’extrêmité + constitue alors la coiffe GTP favorable à la polymérisation du microtubule. Au contraire, lorsque l'extrêmité (+) est riche en GDP (« extrêmité GDP ») ou lorsque la concentration des hétérodimères est faible, celle-ci est instable et est propice à la dépolymérisation [16]. Une des deux molécules de GTP est hydrolysée en guanosine diphosphate (GDP) lors du phénomène d’instabilité dynamique. L’énergie libérée est nécéssaire à la capacité des microtubules à se dépolymériser [12]. Le rôle de la deuxième molécule de GTP n'est jusqu'à présent pas connu [16]. Il a été mis en évidence l’interaction directe entre CRMP2 et les hétérodimères de tubuline a et b. Il a été démontré lors de cette étude que CRMP2 s’associe aux hétérodimères dans un complexe hétérotrimérique « CRMP2-dimères de tubuline » et induit leur polymérisation in vitro [19]. De plus, CRMP2 a été révélé associé aux fibres de microtubules du fuseau mitotique bipolaire des cellules de neuroblastome de souris (N2a) en division [25]. Il est clairement établie que la croissance des axones des cellules nerveuses est sous-tendue par la polymérisation de la tubuline à l’extrêmité + des microtubules [3]. CRMP2 est fortement synthétisée dans les axones en croissance de cultures de neurones d’hippocampe [31]. CRMP2 a été découverte lors d’une immunoprécipitation avec un anticorps dirigé contre la sthatmine [8]. La sthatmine déstabilise les microtubules. Le mécanisme par lequel la sthatmine déstabilise le microtubule est contreversé. Elle agirait par séquestration de la tubuline libre et/ou par déstabilisation directe lors d’une interaction à l’extrêmité des microtubules [10]. Ces données suggèrent donc très fortement que CRMP2 soit impliqué dans les mécanismes moléculaires sous-jacent à la dynamique des microtubules.
Expression des crmp en contexte pathologique Les variations d’expression des protéines CRMP ont largement été décrites dans les maladies
neurodégénératives et cancéreuses. L’expression de CRMP2 est supérieure dans le cerveau des patients atteints de la maladie d’Alzheimer par rapport au sujets sains. Il a été décrit des formes de CRMP2 associées à des aggrégats de la protéine tau encore appelés filaments hélicoïdaux appariés (FHA) [60]. Ces formes associées aux FHA sont des formes hyperphosphorylées sur les résidus Thr 509 , Ser 518 , Ser 522 [24]. Dans la maladie de Parkinson, CRMP2 pourrait être impliquée dans l’apoptose neuronale induite par le neurotransmetteur dopamine [5]. Une faible expression de CRMP1 dans les cellules cancéreuses du poumon est corrélée à l’apparition de métastases. Des cellules transfectées par CRMP1 ont moins de pseudopodes et une capacité réduite d’invasion [53]. Des lésions du système nerveux central peuvent être associées à des cancers périphériques, le plus souvent des carcinomes à petites cellules du poumon. Ces symptômes sont appelées syndromes neurologiques paranéoplasiques. Lors de cette pathologie, les protéines CRMP sont exprimées par les cellules de la tumeur pulmonaire et des auto-anticorps dirigés contre les CRMP sont à l’origine des lésions neuronales [52] [62].
Objectifs expérimentaux Lors de la différenciation et la plasticité cellulaire, les protéines CRMP pourraient jouer le rôle de protéines relais entre les facteurs extracellulaires et le cytosquelette. Cependant, les mécanismes moléculaires précis impliqués dans les rôles de différenciation et de plasticité cellulaire des CRMP ne sont pas encore décryptés. Par ailleurs, aucune fonction enzymatique n’a pu être à ce jour mise en évidence pour cette famille de protéine. Pour appréhender les mécanismes moléculaires mis en jeu dans les rôles cellulaires des CRMP, il apparaît nécessaire de connaître leurs différentes formes protéiques codées par les gènes crmp et modifiées de manière post-transcriptionnelles et post-traductionnelles. Les objectifs généraux des études que nous avons entrepris ont donc été de caractériser et d’identifier les différentes formes de CRMP2 qui découlent des modifications post-transcriptionnelles et post-traductionnelles de l’expression du gène crmp2 , et d’analyser les variations de synthèse de ces formes dans des contextes physiologiques et pathologiques. Pour cela, nous avons mis en place une stratégie expérimentale basée sur une approche protéomique et réalisée au sein de l’équipe de Jean-Jacques Diaz à l’unité CNRS-UCBL 5534. La première étape de notre approche protéomique a consisté à élaborer des cartes protéomiques annotées. Ces dernières permettent de définir pour chaque
