APPORT DE MODELES DE MUQUEUSES HUMAINES IMMUNOCOMPETENTES EN TANT QUE PORTES D'ENTREE DU VIH

MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L’EDUCATION NATIONALE
ET DE LA RECHERCHE


ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES

Sciences de la Vie et de la Terre


MEMOIRE

Présenté

Par

Melle Sandrine GOFFLO


Pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes


APPORT DE MODELES DE MUQUEUSES HUMAINES
IMMUNOCOMPETENTES EN TANT
QUE PORTES D’ENTREE DU VIH



Soutenu le lundi 20 décembre 2004 devant le jury suivant :

Madame CORDIER Geneviève – Présidente
Monsieur EXBRAYAT Jean-Marie – Rapporteur
Madame DAMOUR Odile – Examinatrice SALA Monica
Madame DEZUTTER DAMBUYANT Colette – Examinatrice


Laboratoire d’accueil : Laboratoire EPHE :
EA 37-32 UCBL 1, INSERM Unité 346 Reproduction et développement des vertébrés
Cellules de Langerhans, peau humaine et immunité Directeur : Mr EXBRAYAT Jean-
Marie
Directeur : Mr SCHMITT Daniel Faculté Catholique de Lyon
Hôpital Edouard Herriot – Lyon
EPHE Banque de Monographies SVT 1

RESUME :
L’infection transmuqueuse est l’un des modes majeurs de transmission du Virus de l’Immunodéficience
Humaine de type 1 (VIH-1). Les premières étapes de l’infection : le passage du virus à travers une muqueuse
saine ainsi que sa dissémination reste relativement mal connus. Les différentes populations cellulaires, cibles
privilégiées du virus qui sont présentes au niveau des muqueuses, comme les cellules dendritiques (DC),
possèdent pour la majorité d’entre elles, le récepteur classique CD4 à la glycoprotéine d’enveloppe gp120 du
virus, ainsi que les co-récepteurs CXCR4 et CCR5. Ces cellules sont par conséquent susceptibles d’être infectées et,
ainsi de transmettre l’infection en devenant vecteurs de dissémination virale.
Le modèle d’étude in vitro que nous proposons pour mieux appréhender ces premières étapes de l’infection chez
l’homme est un épithélium pluristratifié, reconstruit à partir de culture de cellules épithéliales et de fibroblastes
fraîchement isolés de biopsies de cols utérins et de vagins. Nous avons intégré à cet environnement épithélial des
précurseurs de cellules dendritiques issus de la culture de cellules souches hématopoïétiques CD34+. La
différenciation de ces précurseurs a été judicieusement orientée vers la voie de différenciation de cellules de
Langerhans (LC) à l’aide d’un environnement cytokinique.
Les observations microscopiques des reconstructions, la présence de cytokératine 13, d’involucrine et l’absence de
loricrine au sein de celle-ci, ainsi que la mesure de la Résistance Electrique Trans-Epithéliale du modèle nous a
permis de valider nos épithéliums reconstruits et ainsi de confirmer leur grande ressemblance à des épithéliums
vaginaux retrouvés in vivo.
De plus, nous avons mis en évidence la présence de jonctions de type serré (« Tight junctions » ou TJ)
majoritairement retrouvées dans les assises supérieures des épithéliums pluristratifiés de par la présence de leurs
protéines spécifiques et de leur ARNm. Nous avons également démontré que les LC expriment les ARNm de
certaines de ces protéines ce qui suggère une capacité à réaliser ce type de jonction avec les cellules épithéliales qui
constituent leur environnement tissulaire.
L’infection expérimentale de ces épithéliums nous a permis de confirmer l’inefficacité du virus libre à traverser
ce type de muqueuse. Comme le virus libre ne semble pas infecter les LC présentes au sein de l’épithélium
reconstruit, nous supposons qu’il ne peut ni franchir l’épithélium, ni utiliser la transcytose ou la rupture des
jonctions serrées. Des expériences futures d’infection expérimentale au moyen de cellules chroniquement infectées
nous permettront de vérifier si le phénomène de transcytose est prédominant par rapport à celui utilisé par le
virus, de rompre les TJ et ainsi favoriser l’infection des LC.
Ces modèles tridimensionnels représentent de bons outils pour la compréhension des mécanismes moléculaires et des interactions
cellulaires fondamentaux. Ils peuvent être considérés comme modèles alternatifs à l’expérimentation animale et ce, dans le cas
d’études toxicologiques, cosmétologiques, pharmacologiques et également virologiques.



MOTS-CLES : Epithéliums reconstruits, cellules de Langerhans, Virus de l’Immunodéficience Humaine,
« Tight Junctions »

SOMMAIRE


1 Introduction




EPHE Banque de Monographies SVT 2
A Les Cellules Dendritiques 2


I Origine des cellules dendritiques 2

1) LA v OIE MYé LOïDE
2) LA v OIE LYMPHOïDE

II Localisation et caractéristiques des différentes sous-populations de DC
3

1) LES CELLULES DENDRITIq UES DES ORGANES NON LYMPHOïDES
2) LES q UES DES LYMPHOïDES
3) Ré PARTITION DES DIFFé RENTES SOUS-POPULATIONS DE DC

III Fonctions des cellules dendritiques 6

1) FONCTIONS DES CELLULES DENDRITIq UES IMMATURES
2) F DES q UES MATURES

IV Production in vitro de cellules de Langerhans 8

+1) A PARTIR DE PROGé NITEURS Hé MATOPOïé TIq UES CD34
2) A DE MONOCYTES HUMAINS


B Les épithéliums de revêtement 10


I Classification des épithéliums 10

1) LES é PITHé LIUMS SIMPLES
2) LES é PITHé LIUMS PSEUDO-STRATIFIé S
3) LES é PITHé LIUMS STRATIFIé S

II Le Vagin : exemple d’épithélium pavimenteux stratifié 11

1) LA MUq UEUSE
2) LA MUSCULEUSE ET L’ADv ENTICE

III Immunité des muqueuses 12





IV Les jonctions serrées ou « Tight junctions » 13

1) MORPHOLOGIE ET COMPOSITION MOLé CULAIRE DES « TIGHT JUNCTIONS »
2) FONCTIONS DES « TIGHT JUNCTIONS »
3) « TIGHT JUNCTIONS » ET CELLULES DENDRITIq UES
4) « TIGHT JUNCTIONS » ET ALLERGè NES
EPHE Banque de Monographies SVT 35) « TIGHT JUNCTIONS » ET vIH

V Divers modèles de reconstructions de muqueuses
17

1) RECONSTRUCTIONS DE MUq UEUSES ORALES ET v AGINALES
SANS INTé GRATION DE CELLULES DENDRITIq UES
2) R DE MUq UEUSES ORALES ET v AGINALES
Av EC INTé GRATION DE CELLULES DENDRITIq UES


C Le Virus de l’Immunodéficience Humaine 20


I Historique 20

II Aspects morphologiques et structuraux 21

III Structure et organisation du génome 21

IV Le cycle réplicatif du VIH-1 23

1) FIXATION ET ENTRé E DU v IRUS DANS LA CELLULE Hô TE
2) TRANSCRIPTION INTé GRATION DU Gé NOME v IRAL ET RELARGAGE DES v IRIONS
3) CO-Ré CEPTEURS ET TROPISME v IRAL

V Infection des muqueuses par le VIH 25

1) v IH ET CELLULES é PITHé LIALES
2) v IH ET DE LANGERHANS





A Préparation et sélection des banques de précurseurs
hématopoïétiques, de cellules épithéliales et de fibroblastes 29


I- Purification des cellules souches CD34+ de sang de cordon
ombilical humain 29

II- Production de population mixte de cellules de Langerhans /cellules
dendritiques interstitielles et caractérisation phénotypique 29

III -Analyse du phénotype cellulaire par cytométrie en flux 30

IV - Constitution de banques d