MINISTERE DE L'EDUCATION NATIONALE
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Niveau: Secondaire, Lycée
MINISTERE DE L'EDUCATION NATIONALE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE Présenté par Christine GIRARD-BLANC Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes ETUDE DE DEUX PROTEINE-SERINE/THREONINE KINASES CHEZ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS, CARACTERISATION BIOCHIMIQUE ET ROLE DANS LE METABOLISME DE LA CELLULE BACTERIENNE Soutenu le 16 septembre 2003 devant le jury suivant : Pr. Y. BENYAMIN Président Pr. J-M. EXBRAYAT Rapporteur Pr. A-J. COZZONE Examinateur Dr. J-F. PROST Examinateur Dr. F. BLEICHER Examinateur Institut de Biologie et Chimie des Protéines Laboratoire de Biologie Moléculaire–UMR 5086 Phosphorylation des Protéines et Pathogénie Bactérienne E-Mail : Directeur d'études EPHE : Pr. EXBRAYAT Laboratoire de Reproduction et Développement des Vertébrés 25, rue du Plat 69 288 LYON Cedex 02 E-Mail : RESUME Ce travail s'inscrit dans le cadre général de l'étude de la phosphorylation des protéines bactériennes, et EPHE Banque de Monographies SVT 1
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MINISTERE DE L'EDUCATION NATIONALE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE Présenté par Christine GIRARD-BLANC Pour l'obtention du diplôme de l'Ecole Pratique des Hautes Etudes ETUDE DE DEUX PROTEINE-SERINE/THREONINE KINASES CHEZ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS, CARACTERISATION BIOCHIMIQUE ET ROLE DANS LE METABOLISME DE LA CELLULE BACTERIENNE Soutenu le 16 septembre 2003 devant le jury suivant : Pr. Y. BENYAMIN Président Pr. J-M. EXBRAYAT Rapporteur Pr. A-J. COZZONE Examinateur Dr. J-F. PROST Examinateur Dr. F. BLEICHER Examinateur Institut de Biologie et Chimie des Protéines Laboratoire de Biologie Moléculaire–UMR 5086 Phosphorylation des Protéines et Pathogénie Bactérienne E-Mail : Directeur d'études EPHE : Pr. EXBRAYAT Laboratoire de Reproduction et Développement des Vertébrés 25, rue du Plat 69 288 LYON Cedex 02 E-Mail : RESUME Ce travail s'inscrit dans le cadre général de l'étude de la phosphorylation des protéines bactériennes, et EPHE Banque de Monographies SVT 1
- protéine-sérine
- phosphorylation des protéines
- enveloppe cellulaire des mycobactéries
- thréonine kinase
- régulation de multiples réponses cellulaires
- salin pcr
- tampon tris salin
- système classique
- arn acide
MINISTERE DE L’EDUCATION NATIONALE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE Présenté par Christine GIRARD-BLANC Pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes ETUDE DE DEUX PROTEINE-SERINE/THREONINE KINASES CHEZ MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS , CARACTERISATION BIOCHIMIQUE ET ROLE DANS LE METABOLISME DE LA CELLULE BACTERIENNE
Soutenu le 16 septembre 2003 devant le jury suivant : Pr. Y. BENYAMIN Président Pr. J-M. EXBRAYAT Rapporteur Pr. A-J. COZZONE Examinateur Dr. J-F. PROST Examinateur Dr. F. BLEICHER Examinateur I nstitut de B iologie et C himie des P rotéines Laboratoire de Biologie MoléculaireUMR 5086 Phosphorylation des Protéines et Pathogénie Bactérienne E-Mail : jf.prost@ibcp.fr Directeur d’études EPHE : Pr. EXBRAYAT Laboratoire de Reproduction et Développement des Vertébrés 25, rue du Plat 69 288 LYON Cedex 02 E-Mail : jmexbrayat@univ-catholyon.fr RESUME Ce travail s’inscrit dans le cadre général de l’étude de la phosphorylation des protéines bactériennes, et
plus particulièrement des Sérine/Thréonine Protéine Kinases (STPKs) chez M. tuberculosis . Les STPKs participent à la régulation de multiples réponses cellulaires aussi bien chez les eucaryotes que chez les procaryotes, et plusieurs études montrent qu’elles pourraient être des cibles dans le développement de nouveaux médicaments. Chez les bactéries, l’étude du rôle de ces STPKs dans la transduction des signaux est un sujet émergent depuis la découverte de ce type de kinase à partir de plusieurs génomes bactériens. Au cours de notre étude, nous nous sommes plus particulièrement intéressés à deux nouvelles STPKs, PknE et PknH, parmi les onze identifiées lors du séquençage du génome de M. tuberculosis . Dans un premier temps, les protéines d’intérêt, PknE et PknH, ont été surproduites et purifiées au laboratoire afin de caractériser leur activité enzymatique. Des tests de phosphorylation in vitro ont ainsi permis de montrer que ces deux enzymes appartenaient à la famille des STPKs de type eucaryote, et qu’elles étaient capables de s’autophosphoryler sur des résidus séryles et thréonyles. Une étude réalisée sur la topologie membranaire de PknE a également permis de caractériser l’organisation de cette enzyme au niveau de la membrane bactérienne, indiquant, notamment, que la protéine PknE est constituée de deux domaines : un domaine N-terminal cytoplasmique portant l’activité kinase, séparé d’un domaine périplasmique par une hélice transmembranaire unique. Par analogie avec les systèmes eucaryotes, ce résultat indique que PknE et PknH pourraient se comporter comme des récepteurs membranaires à activité sérine/thréonine kinase, et ainsi interagir avec certaines protéines et/ou effecteurs pour permettre la transduction d’un signal, qui reste à identifier. Par conséquent, nous nous sommes attachés à caractériser les substrats protéiques de ces kinases. Cette recherche nous a permis de mettre en évidence un substrat pour PknH, la protéine EmbR, qui est phosphorylée sur des résidus thréonyles par PknH. Par ailleurs, nous avons également identifié le rôle essentiel joué par le domaine FHA (ForkHead Associated) de EmbR dans cette réaction de phosphorylation. Ce domaine, décrit pour la première fois expérimentalement chez les procaryotes, semble indispensable à la reconnaissance entre PknH et EmbR. La mise en évidence de ce module dans les mécanismes moléculaires liés à la phosphorylation de EmbR par PknH permet de mieux appréhender la manière dont ces deux protéines interagissent au cours de la réaction de phosphorylation, et, d’un point de vue général, ouvre de nombreuses perspectives dans la caractérisation de nouveaux substrats pour différentes STPKs procaryotes. Enfin, connaissant le rôle joué par la protéine EmbR dans les mécanismes de résistance de M. tuberculosis à l’éthambutol, ces résultats constituent une contribution significative à la compréhension des mécanismes moléculaires liés à la résistance des Mycobactéries aux traitements chimiothérapeutiques. SOMMAIRE Page ABREVIATIONS 1 INTRODUCTION 3 EXPOSE BIBLIOGRAPHIQUE 5
